免疫去势与手术去势对SD雄鼠骨骼肌沉积的差异影响机制

2023-05-06李镇宏李昊卿李嘉欣曾宪垠韩兴发

四川农业大学学报 2023年2期

李镇宏，李昊卿，李嘉欣，曾宪垠，韩兴发

（四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625014）

骨骼肌生长沉积是影响家畜生产性能及饲养经济效益的主要因素之一[1-2]。骨骼肌细胞分化、生长及肌肉沉积受多种内分泌激素调控。公畜中，睾酮和胰岛素样生长因子1（IGF1）是促进骨骼肌生长沉积的主要激素，而糖皮质激素则是引起骨骼肌降解萎缩的主要激素[3]。3 种激素间的动态拮抗平衡是决定公畜骨骼肌沉积量的重要机制[3]。

在畜牧生产中，手术去势又称外科阉割是一种古老且广泛采用的生产管理技术，常用于降低公畜间的爬跨、打斗行为，以及改善畜禽肉品质[4-5]。近年来随着社会对动物福利的日趋重视，手术去势越来越不被人们所接受[6]。目前，促性腺激素释放激素（GnRH）主动免疫又称免疫去势，已成为替代传统手术去势的动物友好的新去势方法[7-8]。研究发现，去势引起的动物性激素缺乏[9]或是衰老引起人的性激素分泌降低[10]均导致骨骼肌萎缩。手术去势与免疫去势均显著降低动物性激素含量[8,11-12]，但免疫去势公畜骨骼肌肉含量通常显著高于手术去势公畜[7-8]。手术去势与免疫去势如何差异影响动物骨骼肌沉，目前鲜见报道。据此，本研究以SD雄鼠为模型，对比研究免疫去势和手术去势对骨骼肌组织学、骨骼肌沉积调控相关激素含量及相关基因mRNA 表达的影响，以解析两种不同去势技术对公畜骨骼肌沉积的差异影响机制。

1 材料和方法

1.1 GnRH疫苗制备

参照我们前期所描述的方法[13]制备GnRH 疫苗。即通过化学合成法合成GnRH 十肽的串联体，为方便与载体蛋白偶联，合成过程中将GnRH 分子中第6 位甘氨酸（Gly）替换为D 型赖氨酸（D-Lys）。多肽合成后与卵清蛋白（OVA）偶联，偶联物经高效液相色谱纯化后与Specol 佐剂乳化，即为GnRH疫苗。

1.2 动物分组及处理

将36 只6 周龄体重相近的SD 雄鼠随机分为3组:对照组（entire males, EM）、手术去势组（orchectomy, ORC）和GnRH免疫组（immunocastration, IM），每组12 只。其中，对照组不做任何处理，手术去势组雄鼠在6周龄时进行手术去势。免疫去势组雄鼠在8周龄时于前腿部肌肉注射0.5 mL 100 µg GnRH肽当量去势疫苗，4 周后以同样的免疫方式和剂量进行加免，对照组和手术去势组雄鼠注射不含GnRH抗原的疫苗乳化剂。试验期间所有雄鼠自由采食和饮水，加免后8周（即20周龄）将所有动物麻醉处死后取样。

1.3 样品采集

20 周龄时，雄鼠过夜饥饿8 h 后称重并在麻醉处死前通过摘眼球法采血。所有血样于4 ℃，2 000 g 离心15 min 后分离血清，血清保存于-20 ℃冰箱，用以测定血清激素及尿素氮含量。雄鼠处死后，迅速分离下肢腓肠肌、睾丸、附睾及肾上腺并称重，计算腓肠肌/体重的比值。部分腓肠肌和睾丸浸泡于4%的多聚甲醛，用于组织学分析，其余组织液氮速冻后转移到-80 ℃冰箱保存待用。

1.4 血清激素及尿素氮含量测定

利用酶联免疫法（ELISA）技术测定雄鼠血清中睾酮（T）、胰岛素样生长因子1（IGF1）和皮质酮（CORT）浓度。测定方法严格参照试剂盒（Cusabio Biotech Co. Ltd）的操作说明书进行，每个样品重复测定2次。睾酮、IGF1及皮质酮测定灵敏度分别为0.06 ng/mL，0.151 ng/mL 及0.1 ng/mL。所测定激素批内及批间变异系数均＜12%。

雄鼠血清尿素氮含量的测定参照我们以前所描述的方法[11]进行。

1.5 腓肠肌及睾丸组织学分析

将经4%多聚甲醛固定的腓肠肌和睾丸通过石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（H&E）染色后，进行光学显微镜观察组织学变化。采用Image J (v. 1.8)显微图像分析软件测定每个样品中100根肌纤维的截面积，算术平均后得到肌纤维的平均截面积。

1.6 基因检测

用液氮将腓肠肌和肾上腺组织研磨至粉状，取约100 mg 组织粉末通过苯酚-氯仿法提取组织总RNA。参照试剂盒（Invitrogen Co. Carlsbad, CA,USA）说明书进行RNA提取。凝胶电泳检测RNA的完整性，然后用Nanodrop 2000 测定总RNA 浓度及纯度。取1 µg RNA用于反转录，反转录试剂采用试剂盒PrimeScript®RT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa, Dalian, China）。以cDNA 为模板，设计基因特异性引物（表1），利用荧光定量PCR方法检测目的基因的表达，每个样品重复3 次。PCR 反应条件: 95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s, 59～61 ℃退火，延伸25 s，反应结束后用熔解检测PCR 扩增产物的特异性。以β-actin为内参基因，目的基因mRNA 表达经内参基因正后，采用2-△△ct法计算其相对表达量。

1.7 统计分析

利用Graphpad Prism 9.2 软件对数据进行统计分析。采用AVOVA单因素方差分析对指标进行组间差异检验，数据结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 雄鼠GnRH免疫去势效果

如图1所示，与对照雄鼠（EM）相比，雄鼠GnRH主动免疫后睾丸（图1A）、附睾（图1B）重量及血清睾酮浓度（图1C）显著降低（P＜0.001）。睾丸组织切片显示，对照雄鼠睾丸结构完整，曲精细管包括各级生精细胞和成熟精子（图1D方框所示），而GnRH免疫雄鼠睾丸曲精细管管腔空荡，精子发生完全被阻断，管腔中无精子细胞和成熟精子，表明GnRH主动免疫达到了良好的免疫去势效果。

图1 GnRH主动免疫对雄鼠睾丸、附睾重量、血清睾酮浓度及睾丸组织学的影响Figure 1 Effects of active immunization against GnRH on testes and epididymides weight, serum testosterone levels and testes morphology in male rats

2.2 GnRH 主动免疫与手术去势对雄鼠骨骼肌萎缩的影响

如图2 所示，与对照组（EM）相比，雄鼠手术去势与GnRH 主动免疫后腓肠肌重量均降低（图2A；P＜0.01），但GnRH免疫组雄鼠腓肠肌重量仍高于手术去势组雄鼠（P=0.09）。当使用体重矫正腓肠肌重量后（即腓肠肌指数）发现，与对照组相比雄鼠手术去势后腓肠肌指数降低（图2B；P＜0.01），而GnRH主动免疫后雄鼠腓肠肌指数仅显示出下降的趋势（图2B；P=0.09），但腓肠肌指数在手术去势组雄鼠与GnRH免疫组雄鼠间无显著差异（P＞0.05）。切片分析显示，虽手术去势和免疫去势对雄鼠腓肠肌肌纤维面积无显著影响（图2C 和D；P＞0.05），但两种去势处理后雄鼠部分腓肠肌肌纤维均出现了降解萎缩的迹象（图2D 箭头所示），且手术去势雄鼠腓肠肌降解萎缩肌纤维数量明显多于GnRH免疫雄鼠（图2D）。

图2 GnRH主动免疫与手术去势对雄鼠腓肠肌重量、指数及组织学的影响Figure 2 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on the mass, ratio and histology of gastrocnemius muscle in male rats

2.3 GnRH 主动免疫与手术去势对雄鼠肝脏重量及血清IGF1浓度的影响

如图3 所示，与对照组（EM）相比，雄鼠GnRH主动免疫与手术去势后肝脏重量及指数均降低（图3A 和B；P＜0.05），且GnRH 免疫组雄鼠与手术去势雄鼠间肝脏重量及指数均无显著差异（P＞0.05）。与对照组（EM）相比，手术去势降低雄鼠血清IGF1浓度（图3C；P＜0.001），而GnRH 免疫仅有降低雄鼠血清IGF1 浓度的趋势（P=0.063）。雄鼠处死时，GnRH 免疫组大鼠血清IGF1 浓度仍显著高于手术去势组大鼠（P＜0.05）。

图3 GnRH主动免疫与手术去势对大鼠肝脏重量、指数及血清IGF1浓度的影响Figure 3 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on the liver mass and ratio, and serum IGF1 concentrations in male rats

2.4 GnRH 主动免疫与手术去势对雄鼠肾上腺重量及皮质酮分泌的影响

如图4所示，与对照组（EM）相比，GnRH主动免疫与手术去势对雄鼠肾上腺重量及指数均无显著影响（图4A 和B，P＞0.05）。与对照组相比，手术去势对雄鼠血清皮质酮浓度无显著影响（图4C，P＞0.05），而GnRH主动免疫却显著降低雄鼠血清皮质酮浓度（P＜0.05）。qPCR 检测肾上腺皮质酮合成关键酶基因mRNA 表达变化，结果发现GnRH 主动免疫显著下调肾上腺HSD3β1（图4D，P＜0.05），而对肾上腺Star和Cyp11a1mRNA 表达无显著影响（P＞0.05）。而与对照组相比，手术去势对大鼠肾上腺上述皮质酮合成关键基因mRNA 表达均无显著影响（图4D，P＞0.05）。

图4 GnRH主动免疫与手术去势对大鼠肾上腺重量、指数及皮质酮合成的影响Figure 4 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on the adrenal mass and ratio, as well as corticosterone biosynthesis in male rats

2.5 GnRH 主动免疫与手术去势对雄鼠血清尿素氮及腓肠肌沉积相关基因表达的影响

如图5所示，与对照组（EM）相比，GnRH主动免疫与手术去势均显著增加血清尿素氮浓度（图5A，P＜0.001），但GnRH 免疫组雄鼠血清尿素氮浓度显著低于手术去势组雄鼠（P＜0.001）。qPCR 分析显示，与对照组（EM）相比，手术去势下调腓肠肌Igf1rmRNA 表达水平（图5B，P＜0.05），而上调MstnmRNA 表达水平（P＜0.05），对Ar及Igf1mRNA 表达无显著影响（P＞0.05）。而，与对照组相比，GnRH主动免疫对大鼠腓肠肌所检测肌肉沉积相关基因mRNA表达均无显著影响（P＞0.05）。

图5 GnRH主动免疫与手术去势对大鼠血清尿素氮及腓肠肌沉积调控相关基因mRNA表达的影响Figure 5 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on serum urea nitrogen levels and mRNA expressions of gastrocnemius accumulation-associated key genes in male rats

3 讨论

骨骼肌约占家畜胴体重的30%～60%，是产肉家畜饲养的主要生产目标。骨骼肌沉积受多种因素影响，其中睾酮和胰岛素样生长因子1（IGF1）是促进公畜骨骼肌生长沉积的主要调控激素[3,9]。去势引起公畜血清睾酮及IGF1浓度显著降低，显著降低公畜胴体骨骼肌含量[8,14-15]。与前人研究结果一致，本研究中雄鼠手术去势后血清睾酮和IGF1 浓度均显著降低，腓肠肌质量和指数均显著降低，表明去势显著降低了雄鼠骨骼肌沉积量。与手术去势一致，GnRH主动免疫也降低雄鼠血清睾酮和IGF1浓度，但GnRH免疫雄鼠血清IGF1浓度仍显著高于手术去势雄鼠。我们前期在猪及大鼠上也得到类似的结果[11-12]。因此，雄鼠GnRH 主动免疫后腓肠肌质量仍高于手术去势雄鼠，这可能与其体内相对较高的IGF1浓度有关。

畜体骨骼肌含量多少是其合成与分解动态平衡的结果[16]。肾上腺分泌的糖皮质激素是促进机体肌肉蛋白分解，致使骨骼肌萎缩减少的重要调控激素[3,17]。本研究中，我们发现手术去势和GnRH主动免疫对雄鼠肾上腺重量和指数均无显著影响，但GnRH 主动免疫选择性降低了雄鼠血清皮脂酮浓度。前人研究结果也显示，去势对公畜例如公猪血清糖皮质激素浓度无显著影响[18]。qPCR分析显示，GnRH主动免疫主要通过下调肾上腺皮质酮合成关键基因HSD3β1的表达，进而降低皮质酮合成。GnRH 主动免疫如何选择性降低肾上腺HSD3β1mRNA表达，进而降低血清糖皮质激素浓度，目前不清楚，有待深入研究。血清糖皮质激素浓度降低意味着由其驱动的肌肉蛋白分解减缓。因此，雄鼠GnRH主动免疫后其骨骼分解萎缩程度较手术去势后低，这还可能与其体内相对较低的皮脂酮浓度有关。

血清尿素氮水平是反映动物机体蛋白分解流失的重要指示指标[19-20]。本研究中，雄鼠GnRH 主动免疫与手术去势后血清尿素氮浓度均显著升高，这与两种去势处理后雄鼠骨骼肌沉积量相较于对照雄鼠均降低的结果一致，表明雄激素浓度降低或缺乏所引起的肌肉蛋白分解是两种去势处理导致雄性动物骨骼肌沉积量减少的共同原因。但值得注意的是，雄鼠GnRH 主动免疫后血清尿素氮浓度仍显著低于手术去势雄鼠，表明免疫去势雄鼠骨骼肌分解程度或速度较低是其骨骼肌沉积量较手术去势雄鼠多的重要原因。同时，qPCR 分析也证实手术去势雄鼠腓肠肌肌肉分解关键基因Mstn表达水平显著高于对照组和GnRH免疫组雄鼠。

对比研究两种不同去势处理对雄鼠腓肠肌沉积关键调控基因转录的影响，结果发现手术去势除选择性上调腓肠肌Mstn表达外，还选择性下调腓肠肌胰岛素样生长因子1受体（Igf1r）基因表达。这表明Igf1r表达的下调也可能是介导手术去势降低动物机体骨骼肌含量的重要原因。除上述两个基因外，两种去势处理均不影响腓肠肌雄激素受体（Ar）及Igf1基因表达。除肝脏分泌的IGF1外，肌肉组织自身产生IGF1 通过自分泌和旁分泌途径在促进骨骼肌生长沉积调控中也发挥重要作用[3]。因此，两种去势处理可能均不会通过影响骨骼肌自身IGF1的合成来调控自身的生长萎缩。同时，两种去势处理降低血液睾酮含量后，也不会通过影响骨骼肌Ar的表达来进一步加剧骨骼肌萎缩。