应用脉冲标记粗枝云杉和四川红杉幼苗的13C分配特征研究

杨玉婷，杨红艳，刘金超，曲炜辰，杜 婷，张 玉，张 丽，游成铭，谭 波，徐振锋，李 晗

（四川农业大学生态林业研究所/长江上游林业生态工程四川省重点实验室/长江上游森林资源保育与生态安全国家林业和草原局重点实验室/高山森林生态系统定位研究站，成都 611130）

20 世纪80 年代以来，稳定碳同位素示踪成为研究生态系统碳循环最科学有效的方法之一，可分析大气-植物-土壤中碳的同位素变化规律，能够真实地反映植物源土壤有机碳的累积及分解转化过程[1-4]。自然界中12C 和13C 的相对丰度分别为98.89%和1.11%，14C只有极微量且具有放射性[5]，无放射性13C 无放射性对人体不具危害且具有标记均匀、可长期标记等优点，因而近年来研究者们更倾向于把稳定同位素13C作为示踪物[6]。目前，碳稳定性同位素人工标记方法主要分为连续标记法和脉冲标记法，与连续标记相比，脉冲标记费用低、设备和环境条件要求简单，在生态系统碳循环研究中得到了广泛应用[7]。国内外许多学者对小麦、水稻和玉米等植物运用脉冲标记法进行同位素标记，研究其生长过程中光合碳的分配和转移，对认识碳的转化途径和地球化学循环具有重要意义[8-12]。

随着研究的深入，稳定碳同位素技术逐渐被用于研究植物-土壤系统碳循环[13-14]、植物体与环境的关系[15-17]、植物群落的动态变化[18]、土壤呼吸的动态变化及区分[19-20]、净生态系统碳交换的区分[21-22]等研究领域。冉珊珊等[23]对互花米草进行了4 次13C 脉冲标记后发现，各器官固定的13C 量随标记次数增加而增加，而孙昭安等[24]在13C脉冲标记法定量冬小麦光合碳分配及其向地下的输入研究中发现，经过4 周的示踪期后，13C 在冬小麦-土壤系统中的分配已基本稳定，已有研究多选取生长周期较短的草本植物进行标记，对生长缓慢的木本植物尤其是针叶树种的标记研究鲜有报道[25-26]。粗枝云杉（Picea asperata）是川西亚高山森林主要的建群种之一，亦是长江上游生态屏障带的重要组成部分[27-28]，而四川红杉（Larix masteriana）作为四川特有彩叶树种[29]，是维持川西亚高山森林生态价值和景观价值的重要组成树种[30]。因此，本研究选取针叶常绿树种粗枝云杉和针叶落叶树种四川红杉幼苗为研究对象，采用13C脉冲标记法，探究标记后两种针叶树种植物体不同器官和土壤13C 富集的分布规律，为了解应用脉冲标记法在针叶树种13C 稳定同位素标记过程中的光合碳分配规律提供科学数据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

以生长良好、无病虫害的5 a 生粗枝云杉和四川红杉幼苗为实验材料，两种幼苗各25 株，高分别为50 cm和120 cm左右。将幼苗移栽至直径20 cm，高30 cm的花盆中。培育土选用幼苗培育原土与营养土的混合土，每盆装土约8 kg。花盆置于恒温20 ℃、恒湿60%并装有定时生长灯的培养室内，模拟幼苗原生环境，每天供给12 h光照。根据土壤水分情况，5～7 d 浇水1 次。培养4 个月后，选择生长状况良好的幼苗进行标记实验。

1.2 13C脉冲标记

在幼苗生长旺盛期2020 年8 月初开始13C 标记实验，间隔10 d，共标记4 次，每次标记均在晴朗白天进行。将生长架用透明加厚塑料膜覆盖，用丁基防水胶带内外密封（架高1.9 m、长4.2 m、宽0.8 m），上下层生长架分别放置粗枝云杉和四川红杉幼苗，利用Na213CO3（99 atom%13C）与2 mol/L HCL 反应提供13CO2进行标记。在箱内安装4个小型电风扇，用于保证箱内气体混合均匀。另选取四川红杉和粗枝云杉未标记的幼苗各6株作为对照。具体标记步骤为[23]：

①.生长架每层放置4 个250 mL 的烧杯，其中2 个烧杯中放置5 g Na213CO3，另外2 个烧杯中放置5 g Na212CO3；

②.标记箱每层放置2 个1 L 量杯，向量杯中分别倒入250 mL 500 g/L NaOH，密封标记箱，打开风扇，让幼苗进行光合作用的同时吸收CO2，造成幼苗“饥饿”状态，提高后期幼苗对13CO2的固定;

③.一段时间后，取出量杯，关闭生长灯，迅速分别向每层装有Na213CO3的1个烧杯中倒入200 mL 2 mol/L HCL 溶液，待反应5 min 后，打开生长灯，打开风扇，静待幼苗进行光合作用45 min；

④.重复步骤③，继续向每层装有Na213CO3的另1个烧杯中倒入HCL 溶液产生13CO2，静待幼苗进行光合作用45 min。最后2 次则分别向每层装有Na212CO3的烧杯中倒入HCL 溶液产生12CO2，同样前后分别静待幼苗进行光合作用45 min，促进箱内13CO2同化，减少13CO2的损失，提高幼苗对13C 固定率。

⑤.整个标记过程持续5 h，标记完成后，撤除塑料盖膜。

1.3 样品采集与室内分析

脉冲标记完成后，对幼苗进行干旱处理，待幼苗枯死叶片凋落后，分别从组合标记架上随机采集粗枝云杉和四川红杉标记各6株以及未标记幼苗各6株，每株幼苗分别采集叶片、枝、根以及盆中土壤，密封带回实验室。采集植物器官和土壤样品用去离子水洗净后，于65 ℃烘干至恒重，分别磨碎混匀，过200 目筛，采用同位素质谱仪（CCIA-38, ABB Inc, Canada）测定δ13C值。

1.4 数据统计分析

采用配对样本t-检验比较各树种幼苗同一器官（土壤）在标记前后δ13C值的差异显著性；利用双因素方差分析检验器官（土壤）和树种以及二者交互作用对标记前后幼苗13C 分布的影响。以上分析在Microsoft Excel 2013、SPSS 27.0（IBM Corp.）和Prism 8.0（Graphpad Software Inc.）中运行，显著性水平设定为α = 0.05。

2 结果与分析

2.1 脉冲标记前后粗枝云杉与四川红杉各器官δ13C值变化

由图1（a）可见，未标记粗枝云杉的根、枝、叶和土壤的δ13C 值范围分别为：-27.01‰～-26.87‰、-27.54‰～-27.58‰、-29.11‰～-29.02‰和-26.01‰～-25.87‰，其表现为叶＜枝＜根＜土壤，但是粗枝云杉根、枝、叶片以及土壤中δ13C值差异不明显；而经过了4次13C脉冲标记后，粗枝云杉的根、枝、叶和土壤的δ13C值范围分别为：-23.02‰～63.97‰、-23.72‰～18.52‰、-20.09‰～14.09‰ 和-20.27‰～-15.71‰，其表现为土壤＜枝＜叶＜根，并且粗枝云杉根的δ13C值远大于粗枝云杉其他器官或土壤的δ13C 值，土壤的δ13C值远小于粗枝云杉其他器官的δ13C值。对粗枝云杉不同器官（土壤）标记前后δ13C 值进行配对样本t-检验，结果表明：粗枝云杉各器官以及土壤在标记前后均差异显著（P＜0.05）。

图1 标记前后粗枝云杉（a）与四川红杉（b）不同器官（土壤）δ13C值 (n=6)Figure 1 δ13C values of different organs(soil) of P. asperata (a) and L. masteriana (b) before and after labeling (n=6)

由图1（b）可见，未标记四川红杉的根、枝、叶和土壤δ13C值表现为枝＜根、叶＜土壤，其根、枝和土壤的δ13C 值 范 围 分 别 为：-27.67‰～ -27.54‰、-28.98‰～-28.95‰和-26.67‰～-26.54‰，叶的δ13C值均为-27.57‰，但是未标记四川红杉根、枝、叶以及土壤的δ13C 值差异不明显；完成4 次脉冲标记后，四川红杉根、枝、叶以及土壤δ13C 值表现为土壤＜根＜枝＜叶，其根、枝、叶和土壤的δ13C 值范围分 别 为：25.33‰～171.64‰、36.68‰～206.84‰、79.40‰～230.91‰和-16.49‰～-11.28‰，并且四川红杉中叶的δ13C 值远大于四川红杉其他器官以及土壤中的δ13C 值、土壤中的δ13C 值远小于四川红杉其他器官中的δ13C 值、根与枝中的δ13C 值相接近。对四川红杉不同器官标记前后δ13C 值进行配对样本t-检验，结果表明：四川红杉各器官以及土壤在标记前后均差异显著（P＜0.05）。

2.2 粗枝云杉和四川红杉13C分布规律的差异

将未标记的四川红杉与粗枝云杉各体内器官与土壤中的δ13C进行比较发现：13C在四川红杉与粗枝云杉各器官以及土壤中无明显差异且均表现为叶＜枝＜根＜土壤；而对标记后四川红杉与粗枝云杉各幼苗体内器官与土壤中的δ13C值作比较，结果显示标记后四川红杉13C富集量明显高于粗枝云杉13C富集量，四川红杉与粗枝云杉δ13C 值表为：四川红杉＞粗枝云杉，且四川红杉叶的13C富集量远高于四川红杉其余器官或土壤以及粗枝云杉各器官或土壤中的13C 富集量，其δ13C 值在标记前为-27.57‰，标记后δ13C 达到79.40‰～230.91‰，而粗枝云杉与四川红杉土壤的13C富集量相接近，其δ13C值分别为-20.27‰～-15.71‰、-16.49‰～-11.28‰。对标记前后四川红杉和粗枝云杉不同器官（土壤）δ13C值进行双因素分析，结果表明：器官（土壤）、树种以及二者的交互作用对标记前后幼苗的13C 分布均具有显著的影响（表1）。

表1 标记前后四川红杉和粗枝云杉不同器官（土壤）δ13C值的双因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA results of δ13C values in different organs(soil) of L. masteriana and P. asperat before and after labeling

3 讨论

3.1 脉冲标记13C在不同树种的富集分布规律

近年来，稳定性同位素技术的发展使得定量研究光合产物碳的去向成为可能[31]，发现器官（土壤）、树种以及二者的交互作用对标记前后幼苗的13C 分布均具有显著影响。在脉冲标记13C 时各器官及土壤13C 的富集量总体表现为：四川红杉＞粗枝云杉，并且四川红杉叶片富集的13C 值远高于其他器官或土壤的13C 富集。造成这种差异的原因可以从两种树种的形态特征和对环境的适应性展开。

植物通过光合作用固定13CO2，将光合碳产物输送至植物体各个部位，并通过根系转移到土壤，经过土壤微生物作用最终回归大气或以有机质的形式固定在土壤中。在这个过程中，由于不同植物的形态特征及对环境的适应性不同，其对光合产物的分配和累积情况也不同[31]。相关研究表明，叶片作为光合作用主要器官能直接影响植物的光能利用率和CO2固定能力。孟猛等[32]研究表明，具有较大叶面积指数的樟树相比于夹竹桃樟树能够接受更多的光合有效辐射，从而使得光合固定碳的能力得到明显提升[33-34]。同时，叶片的δ13C 值还受环境温度、相对湿度、光照与海拔等因素影响[35-36]。在本研究中四川红杉各器官及土壤对13C 的富集量高于粗枝云杉，可能是因为四川红杉叶面积相比于粗枝云杉更大，能够固定更多的13C；此外，四川红杉与粗枝云杉最适生长的环境状况也存在差异：四川红杉幼龄阶段有明显的速生性，为中国落叶松属植物中较耐阴的种类，喜温凉、湿润气候；粗枝云杉稍耐荫，能耐干燥及寒冷的环境条件。在本研究中空气湿度更适于四川红杉生长，从而使得四川红杉的光合速率相对更快，对13C的富集量更大。

3.2 脉冲标记13C在不同器官的富集分布规律

植物体器官在生长发育与生理代谢过程中执行功能和养分需求不同，使得植物体对于光合产物在器官间的分配存在差异。在本研究中，不同器官（土壤）对标记前后13C富集量具有显著影响。植物主要依靠叶片的光合作用13C 固定在植物体内，并在植物-土壤系统中进一步分配，经过4次脉冲标记后，四川红杉各器官（土壤）13C丰度值表现为：叶＞枝＞根＞土壤；粗枝云杉各器官（土壤）13C 丰度值表现为：根＞叶＞枝＞土壤。两种树种叶、枝和根的13C 富集量均大于土壤，这与冉珊珊等[24]用13C脉冲标记法研究互花米草光合碳的分配和安婷婷等[9]标记玉米1 d后同一处理组13C丰度变化的研究结果一致。此外，器官间光合产物差异也与外部环境相关，但是本研究仅在4 次标记完成后进行一次性采样，无不同采样时间对比，未能对各器官13C 富集量细微变化进行追踪。

而在不同物种间器官的13C 富集量又存在着差异。早前的研究发现植物光合固定的13C 在不同器官的分配通常表现为茎、叶＞根，这与其本身生理生化过程有关，大部分固定的碳留在地上部分[37-38]；而在本研究中，四川红杉叶的13C 富集量要显著高于其他器官，从植物形态学上看，光合产物的运输规律是先满足上部器官的积累后再满足下部器官的积累，这符合光合产物分配的“就近原则”，而粗枝云杉根的13C 富集量要高于其他器官。可能是由两树种的生长特征差异引起，四川红杉作为速生树种，幼苗期注重于叶（地上部分）的生长；而粗枝云杉在幼龄期生长缓慢[39]，注重根系（地下部分）生长和养分积累，从而呈现以上结果。

综上所述，脉冲标记法在实现针叶树种13C 稳定同位素的标记中效果良好。经过4 次标记，两树种各器官和土壤的13C 丰度在标记前后发生了显著的改变，且落叶树种四川红杉表现出对外源13C 更好的固定能力，其中叶片在各器官中实现了最多的13C 富集。这些结果表明脉冲标记法在探究幼苗期针叶树种器官-土壤中光合产物分配规律方面效果良好，为稳定同位素脉冲标记法在植物生理和生态中的应用提供了一定的基础数据和技术支持。但本研究整个标记过程均在室内模拟进行，不能完全代表高山植物生长的实际环境，且不同植物的标记时间、次数分别对不同器官标记效果的影响也有待进一步探究。