干扰ACACA基因对猪原代肌卫星细胞增殖和成脂转分化过程的影响

2023-05-06雷宇航黄志洋赵梦颖甘麦邻沈林園

四川农业大学学报 2023年2期

雷宇航，谭娅，黄志洋，赵梦颖，齐婧，甘麦邻，沈林園*，朱砺*

（1. 四川农业大学畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室，成都 611130；2. 四川农业大学动物科技学院/农业农村部畜禽生物组学重点实验室，成都 611130；3. 贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵阳 550005）

中国不仅是世界上生猪饲养规模最大的国家，而且还是世界最大的猪肉消费国，猪肉品质在很大程度上决定了生猪行业经济效益及产业发展，因此提高猪肉质量成为该行业重中之重亟需解决的问题[1]。一般意义上，猪肉品质包含pH值、嫩度、系水力以及肌内脂肪含量等指标[2]。在影响猪肉品质的诸多因素中，肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）含量是一项关键指标，它与猪肉的嫩度、风味、多汁性都具有明显关联[3]。肌内脂肪组织又俗称“大理石纹”，属于肌肉脂肪中的一种，由散布在肌纤维束之间的脂肪细胞组成，是衡量肉类营养和风味的重要指标[4]。目前普遍认为猪肉最佳肌内脂肪含量在2%～3%之间，当肌内脂肪含量高于3%时，猪肉口感变得太过油腻会降低消费者购买意愿；而肌内脂肪含量太低则会导致猪肉品质下降，因此合理控制肌内脂肪含量成为了本行业的研究重点[5-6]。

有研究显示猪肌内脂肪包括肌纤维内的脂滴沉积在肌纤维之间和肌纤维束之间的脂肪，其发育和代谢过程与身体其他部位的脂肪有明显的差别[7]。肌肉中能分化为脂肪细胞的干细胞有两种，即脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）和肌肉卫星细胞（MSCs）。这两种细胞之间存在密切联系，其中ADSCs 能够分泌一些调控因子，调控MSCs 增殖以及向脂肪细胞转分化[8-10]。另外，在胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤和罗格列酮等成脂诱导因子的作用下，体外培养的间充质来源不同的细胞（包括卫星细胞）同样能够向脂肪细胞分化[11-13]。这些研究表明肌内脂肪既可由肌肉内前体脂肪细胞发育而来，也可通过MSCs 转分化为脂肪细胞这一调控机制进行，并且肌内脂肪含量与MSCs的增殖和成脂转分化过程息息相关[14-16]。

ACACA属于羧化转移家族的成员，是脂肪酸代谢过程中的关键因子，其序列753-818处有生物素/硫辛酸附着位点[17]。该酶在哺乳动物中以两种方式存在，分别为ACACA基因编码的ACC-1 以及ACACB基因编码的ACC-2，两者具有高度的相似性，互为同工酶。其中ACC2 主要存在于脂肪分化活跃的组织，其作用是催化脂肪酸的氧化；而ACC-1主要存在于哺乳动物肝脏和脂肪组织内，能参与脂肪酸合成代谢，催化乙酰辅酶A羧化成不饱和脂肪酸合成起始产物，即丙二酰辅酶A[18]。丙二酰辅酶A 是线粒体内β 氧化的重要调控因子，充当不饱和脂肪酸合成的限速酶，可直接影响人类的脂类代谢[19-22]。在前期本研究团队已经证实ACACA在高肌内脂肪含量的猪群体中呈现高表达趋势[23]。另外据相关研究表明，ACACA基因在高肌内脂肪含量的莱芜猪肌肉中的表达量明显高于肌内脂肪含量低的DLY 猪，ACACA与肌内脂肪含量呈现正相关[24]。D. Gallardo 等[25]研究也发现，在杜洛克猪中ACACA基因的两个连锁同义突变对肌肉中脂肪酸组成（包括多不饱和/饱和脂肪酸比值）有显著影响，这些研究均提示ACACA与猪肌内脂肪有相关性。

因此，本研究以猪MSCs为模型，通过体外培养诱导其转分化，模拟肌内脂肪的生成，探究干扰ACACA基因后对猪MSCs 增殖凋亡及转分化的影响，进而揭示其成脂转分化的分子机制，为研究猪肌内脂肪生成分子调控机制和改善猪肉品质提供有关理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

胎牛血清（FBS）、DMEM/F12 培养基购于Gibco公司；油红O 染液、胰岛素（insulin）、地塞米松（DEX）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和罗格列酮（Rosiglitazone）购于Sigma公司；甘油三酯（TG）检测试剂购于南京建成生物工程研究所；Trizol（总RNA 抽提试剂）购于Invitrogen 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖/毒性检测试剂盒购于日本DOJINDO 公司；PI/Rnase Cell cycle staining Buffer 细胞周期试剂盒购于美国BD 公司；Lipofectamine™3000 转染试剂购于ThermoFisher 公司；Prime Script Reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒和SYBR Permix Ex Taq Kit 购于TaKaRa 公司；qRT-PCR 引物合成于擎科生物公司（成都）；使用CFX96荧光定量仪（Bio-Rad，美国）、Cytoflex 流式细胞仪（Backman，美国）、酶标仪（Thermo，美国）、Olympus IX53 荧光显微镜（Olympus，日本）。

1.2 试验方法

1.2.1 猪原代肌卫星细胞体外分离

无菌采取3 日龄的DLY 仔猪背最长肌组织，用含3%双抗的PBS缓冲溶液清洗3～5次，剔除血管和结缔组织，用手术剪剪成肉糜状。经Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化后，将消化液用100 µm 的细胞筛过滤，1 000 g/min转速离心10 min后倒掉上清，收集底部细胞，加入20%培养基重悬，铺瓶，将培养瓶置于含5% CO2，37 ℃恒温细胞培养箱中培养。由于原瓶中细胞种类较多，含有大量成纤维细胞、骨骼肌卫星细胞、组织等，其中成纤维细胞具有较强的贴壁能力最强[26]，因此在3 h后将原瓶中上清液转移至新的培养瓶中，未贴壁细胞继续培养，重复一次，最终采用差速贴壁法对猪MSCs进行分离纯化。

1.2.2 猪原代肌卫星细胞传代与诱导成脂转分化

待培养瓶中细胞密度达到80%左右，经胰蛋白酶消化后，按照1∶3 的比例进行传代培养。当培养板内细胞密度达到90%时，将完全培养基更换为成脂诱导A 液（DMEM+20% FBS+1%双抗+1 µmol/L DEX+20 µg/mL Insulin+0.5 mmol/L IBMX+10 µmol/L Rosiglitazone），培养2 d 之后，更换为成脂诱导B 液（DMEM+20% FBS+1%双抗+20 µg/mL Insulin），每2 d换液一次，并在显微镜下拍照记录。

1.2.3 小干扰RNA（siRNA-ACACA）的合成

针对猪的ACACA基因的保守序列，由吉玛基因（Gene Pharma）公司（上海）设计并合成3 条小干扰RNA，序列见表1。

表1 ACACA的siRNA序列Table 1 The siRNA sequence of ACACA

1.2.4 细胞转染

为了探究siRNA-ACACA对猪原代肌卫星细胞增殖凋亡以及转分化的影响，将细胞接种于12孔细胞培养板，分别在增殖期和转分化期将3 种小干扰RNA（si-ACACA1、si-ACACA2、si-ACACA3）和一组对照组（NC）转染进细胞，每组处理设置3个重复。转染液按照Lipofectamine™ 3000说明书进行配制。

1.2.5 CCK-8细胞增殖检测

将细胞接种至96 孔板，每组处理6 个孔，每个孔100 µL 细胞悬液。将培养板置于含5% CO2，37 ℃恒温细胞培养箱中预培养24 h，当细胞密度达到30%时转染细胞并换增殖培养液。转染细胞后，设定5 个时间点（0、12、24、48、72 h）向待检测细胞孔中加入10 µL CCK-8检测试剂，孵育1.5 h后利用酶标仪检测在450 nm 波长处的OD 值，确定细胞增殖活力。

1.2.6 流式细胞检测

细胞转染24 h 后，用胰蛋白酶消化细胞，并以1 000 r/min离心5 min（收集约6×105个细胞）。加入4 ℃ 70%乙醇2 mL，于冰上处理30 min。加入2 mL 4 ℃的PBS 液，旋涡混匀300 g 离心5 min，重复此步骤。加入500 µL 的PI/Rnase staining Buffer，4 ℃孵育30 min，加入2 mL 的PBS 液洗涤一次，加入400µL的PBS液重悬细胞。使用流式细胞仪上机检测，采用Modfit软件进行数据分析。

1.2.7 甘油三酯检测

收集转分化第8 天的细胞培养液上清，参考甘油三酯试剂盒说明书，利用酶标仪操作比色法测定上清液中甘油三酯的相对含量。

1.2.8 油红O染色

MSCs 在转分化第8 天时用4%多聚甲醛固定1 h，PBS漂洗3 min，60%异丙醇冲洗15 s，促进中性脂肪的染色。随后在避光处用油红O 染液浸染15 min，每个处理组随机选取5 个点在倒置荧光显微镜下拍照，并用Image J软件量化脂滴面积。

1.2.9 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

用Trizol 试剂裂解细胞，加入氯仿使溶液分为水相和有机相，吸取上层水相用异丙醇沉淀回收RNA。随后使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒将RNA 反转录为cDNA，RTPCR 检测增殖、分化相关基因表达水平。PCR 反应体系为SYBR Premix Ex Taq™ 5 µL，DEPC 水3 µL，上下游引物各自0.5 µL，cDNA 1 µL。反应条件：95℃预变性15 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共计40个循环。以β-actin作为内参基因，使用2-△△Ct方法计算目的基因的相对表达含量[27]。qRT-PCR反应的引物序列见表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 The primer sequence for qRT-PCR

1.3 数据统计分析

所有数据采用GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计学分析，使用独立样本t检验进行差异显著性检验。数据均以平均值（mean）±标准差（standard deviation，SD）表示。

2 结果与分析

2.1 猪MSCs分离培养结果

刚分离下来的猪原代肌卫星细胞在明场下观察呈现亮白小圆点，悬浮于培养液之中（图1A）。培养6 h之后，转移上清液至新培养瓶，更换新鲜培养液继续培养，此时上清液中少量原代肌卫星细胞开始在培养瓶上贴壁，呈现细胞样，向四周伸展；未贴壁细胞依旧呈现圆形白点状（图1B）。培养24 h 之后，绝大多数细胞贴壁（图1C），此时更换培养液，去除仍未贴壁细胞。经过48 h 后，细胞大量增殖，细胞形态逐渐呈现出纤维状或梭形（图1D）。

图1 不同培养时间猪原代肌卫星细胞形态Figure 1 The morphology of porcine primary muscle satellite cells at different culture time

2.2 siRNA-ACACA的干扰效率

qRT-PCR 检测结果如图所示（图2），与NC 未转染组相比，转染si-ACACA之后ACACA的mRNA表达量均下降，且si-ACACA1、si-ACACA2、si-ACACA3 的干扰效率分别为56.04%、88.43%、72.06%。其中si-ACACA2 干扰效率最好，较NC 组有极显著差异（P＜0.000 1），从而筛选出si-ACACA2对猪MSCs进行转染，用于后续实验。

图2 siRNA-ACACA的筛选Figure 2 The screening result of siRNA-ACACA

2.3 干扰ACACA基因对猪MSCs增殖的影响

转染24 h之后，通过CCK-8试剂盒测定细胞活力，结果显示：当细胞培养到12 h 和24 h 时，NC 组与si-ACACA2 组在450 nm 处OD 值基本相同，细胞数目没有明显差异；当细胞培养到48 h 时，si-ACACA2 组OD 值显著低于NC 组（P＜0.05）；当细胞培养到72 h 时，si-ACACA2 组OD 值极显著低于NC组（P＜0.01）（图3A）。

转染细胞24 h 后，经过流式检测分析发现，si-ACACA2组相比于NC组，G0/G1期细胞比率由53.15%（55.3±2.66）上升到60.67%（60.32±0.36）（P＜0.05），G2/M 期变化差异不大，S 期细胞数量由35.47%（33.05±3.35）下降到27.47%（28.44±0.97）（P＜0.05）（图3B和C）。

图3 干扰siRNA-ACACA后对猪原代肌卫星细胞增殖的影响Figure 3 Effect of interfering siRNA-ACACA on proliferation of porcine primary muscle satellite cells

实时荧光定量PCR 检测细胞增殖相关基因（Cyclin D1、Cyclin E）的表达量，结果显示：干扰ACACA能够降低Cyclin D1（P＜0.05）（图3D）和Cyclin E（P＜0.000 1）的表达量（图3E）。

以上结果表明：抑制ACACA基因之后，猪MSCs活性和新生细胞比率均极显著低于对照组，细胞周期相关基因Cyclin D1和Cyclin E表达量显著降低，G0/G1 期细胞比例显著增多（P＜0.05），而S 期细胞比例显著降低（P＜0.05）。说明干扰ACACA可抑制猪MSCs 从G1 期向S 期转变，从而导致G0/G1 期阻滞，细胞增殖受到抑制。

2.4 干扰ACACA基因对猪MSCs凋亡的影响

转染24 h后，利用qRT-PCR检测凋亡标志基因在细胞样本中的表达量。结果显示，si-ACACA2 组与NC组相比，BAX表达量显著升高（P＜0.05），BCL-2表达量显著下降（P＜0.05）（图4A和B）。由此可以推测，干扰ACACA基因可以显著促进猪MSCs凋亡。

图4 干扰siRNA-ACACA 24 h后对猪原代肌卫星细胞凋亡的影响Figure 4 Effect of interfering siRNA-ACACA after 24 h on apoptosis of porcine primary muscle satellite cells

2.5 诱导猪MSCs转分化结果

增殖期细胞融合度达100%时，更换成脂诱导液，继续培养至8 d左右，细胞形态逐渐由纤维状变为椭圆形，并且伴随有明显脂滴出现，猪原代肌卫星细胞成功转分化为脂肪细胞（图5A）。通过实时荧光定量PCR 分别对转分化不同时期的细胞进行成脂和成肌相关标志基因表达量的检测，进一步验证脂肪细胞的形成，结果如下图所示：成脂相关基因C/EBPα的表达量在转分化时期显著高于第0天，并且在第2 天左右表达量达到最高，随后开始逐渐降低（图5B）；成肌相关的基因MyoD和MyoG的表达量与转分化第0 天相比均呈现极显著下降的趋势（P＜0.001），其中MyoD的表达量从第2 天开始逐渐升高，而MyoG的表达量逐渐递减，到第8 天时表达量最低（图5C 和D）。成肌基因与成脂基因的表达量变化在猪MSCs 转分化时期呈现相反趋势，成功诱导猪MSCs向脂肪细胞转分化。

图5 诱导MSCs转分化结果Figure 5 The result of induced transdifferentiation of MSCs

2.6 干扰ACACA 基因对猪MSCs 成脂转分化的影响

转染之后，对转分化第8 天细胞进行油红O 染色发现，si-ACACA2 组中红色脂滴产生量明显少于NC 组，并且脂滴大小也明显小于NC 组（图6A 和B）。检测甘油三酯含量同样发现，si-ACACA2 组中甘油三酯的含量显著低于NC 组（图6C）。因此，干扰ACACA基因可以阻碍猪MSCs转分化时期脂肪沉积作用。

图6 干扰ACACA后对猪原代肌卫星细胞转分化时脂滴形成的影响Figure 6 The effect of ACACA interference on lipid droplet formation during transdifferentiation of porcine primary muscle satellite cells

3 讨论

ACACA基因定位在猪的12号染色体，其编码的乙酰辅酶A 羧化酶α 属于羧化转移家族成员，是脂肪酸从头合成途径中的关键酶，可促进乙酰辅酶A转变为丙二酸单酰辅酶A，能提供脂肪酸合成所需的二碳单位[28]。有研究表明ACACA转录水平含量决定细胞和/或个体脂肪酸合成，维持正常生存。如杨青[29]发现在谷氨酸棒杆菌中过表达ACACA可显著促进脂肪酸合成，提升效率接近2倍之多。相反，当ACACA基因受到抑制后，脂肪酸的合成明显受到阻碍，并且对多种细胞的增殖及个体生长发育会产生负调控作用。Liao T.等[30]通过抑制KMT5A的表达间接抑制了ACACA的表达，从而可使人甲状腺乳头状癌细胞系（PTC）的增殖减弱，并促进其凋亡。E. C. Jessica 等[31]通过双转染siRNA 直接抑制ACC1和ACC2 mRNA 水平的表达量，同样发现人胶质母细胞瘤的增殖受到抑制，并且其新生脂肪产生量也显著降低。Zhang H.等[32]发现前列腺癌组织中ACACA的表达量非常高，与前列腺癌细胞增殖速度快有一定相关性，但是沉默ACACA的表达可以抑制前列腺癌细胞增殖并诱导其凋亡，研究还揭示ACACA对前列腺癌细胞增殖调控的作用机制，发现其是通过影响NAD+/NADH、线粒体ATP 产量、mtDNA 和ROS 水平的平衡，干扰线粒体的正常功能，从而降低细胞的增殖能力。程婧等[33]在对肾透明细胞癌研究同样发现下调肾透明细胞癌786-O和Caki-1细胞中ACACA的表达，能抑制细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4表达进而影响细胞增殖。在活体实验上，L. Abu-Elheiga等[34]发现双敲除ACACA基因，对小鼠胚胎具有显著致死效应。同样，本研究发现通过在体外培养的猪MSCs中干扰ACACA基因可导致细胞增殖受阻，细胞发生G0/G1期阻滞，并且伴随细胞周期标志基因（Cyclin D1、Cyclin E）的表达量显著下降。细胞凋亡相关基因BAX显著升高，BCL-2显著下降，从而加速猪MSCs 凋亡。这些结果提示MSCs 干扰ACACA后增殖受阻与G0/G1期阻滞以及细胞凋亡增强密切相关。

猪肌内脂肪的形成不仅与遗传因素有关，而且更多受到营养条件的影响。动物骨骼肌卫星细胞作为肌内脂肪形成的细胞之一，可以通过体外添加胰岛素、罗格列酮、地塞米松等进行诱导培养，促进向脂肪细胞转化[16,26,35]。其中胰岛素作为机体内唯一降低血糖的激素，可以促进脂肪的合成[36]；罗格列酮则是PPARγ的激动剂，通过激活脂肪细胞标志物脂蛋白脂酶（LPL）的表达以及下调丝裂原激活蛋白激酶激酶3（MAP2K3）的表达来诱导脂肪细胞的形成[37]；DEX 可以促进C/EBPα的表达，而C/EBPα是脂肪形成过程中的关键因子[38]。因此无论成肌细胞是否有内在成脂能力，均可通过PPARγ和C/EBPα这两种成脂转分化因子的异位表达来诱导转分化为成熟脂肪细胞。闫研[12]研究表明通过上调延边牛骨骼肌卫星细胞中PPARγ的表达，可以促进肌肉卫星细胞成脂转分化。皇甫一凡[39]研究证明，在牛成肌细胞内过表达C/EBPα同样也可以诱导成肌细胞向脂肪细胞转分化。另外，C. Fux 等[40]研究证实，C2C12 成肌细胞向脂肪细胞转分化过程中，脂肪细胞的形成仅在C/EBPα表达最高时发生，这也说明C/EBPα的高表达对于成脂转分化至关重要。因此，本研究通过体外添加胰岛素、罗格列酮、地塞米松等，进而上调MSCs 内C/EBPα的表达，检测了成脂相关基因C/EBPα和成肌相关的基因MyoD、MyoG在转分化过程中表达量的变化，成功诱导MSCs 向脂肪细胞转分化。其中C/EBPα基因作为脂肪细胞形成的标志物，其表达量在转分化时期极显著高于转分化开始。而生肌调节因子家族（myogenic regulatory factors， MRFs）中的生肌决定因子（MyoD）和肌生成素（MyoG）在肌肉的形成和分化起着重要作用，前者对于成肌细胞分化起决定性作用，而MyoG则是分化后期形成肌管和肌纤维所必需的。在转分化过程中，猜测是由于肌卫星细胞向脂肪细胞转分化，从而抑制肌管的形成，导致MyoD和MyoG的表达量则始终低于转分化开始时，具体的机制还有待进一步验证。在表观层面，通过油红O染色显示干扰ACACA基因后会明显阻碍转分化时期脂滴的累积过程，抑制了脂肪沉积过程。