玉米bZIP基因应答逆境胁迫的表达模式分析

贾利强，刘 洋，丁 波，张运林，赵秋芳，陈 曙

（1. 贵州师范学院生物科学学院，贵阳 550018；2. 嘉兴职技术学院，浙江 嘉兴 314036；3. 中国热带农业科学院，广东 湛江 524091）

玉米生长进程中经常遭受各种逆境胁迫，包括高盐胁迫、水分缺乏或极端温度胁迫等，影响作物正常生长，导致减产或绝产，国家粮食安全受到影响。植物应答逆境胁迫的信号途径是复杂的，涉及到多层次生理生化响应途径和相应调控基因的参与[1]。转录因子（TFs）就是植物适应抵御逆境胁迫的关键调控因子，影响作物的生长发育及产量[2]。作为数目最多，普遍分布的转录因子家族，bZIP基因在维持植物正常的生长发育或抗逆性等方面具有关键作用。许多研究结果表明bZIP基因参与调控植物众多生理生化进程，诸如种子萌发生长、花发育和结实、植物衰老、逆境胁迫以及激素和光信号转导途径等[3-8]。在作物中超表达bZIP基因会提高其抗逆性，诸如提高作物抗盐、干旱或者极端温度胁迫等逆境环境的能力[3,7-13]。bZIP转录因子家族都存在一个保守的bZIP结构域，该结构域的N端都含有N-x7-R/K-x9保守基序，作为入核信号和结合下游核酸特定序列，C 端由保守的重复亮氨酸拉链蛋白基序组成的a-螺旋结构，二聚体化构成超螺旋结构，控制目标基因的表达[14]。

近些年来，bZIP基因家族在众多植物中得到报道，包括拟南芥（78个）[15]、葡萄（55个）[16]、水稻（89个）[17]、玉米（125个）[18]、高粱（92个）[19]、荞麦（96个）[20]、油菜（247 个）[21]、大豆（131 个）[22]、芝麻（63 个）[13]和番茄（69个）[23]。马铃薯（80个）[24]和辣椒（60个）[7]。

玉米是我国主要的粮、经、饲兼用大田作物，为确保我国粮食安全起到基石作用。在玉米收获前，往往遭遇各种逆境胁迫威胁，致使生产者遭受严重经济损失，粮食安全面临考验，高产稳产、抗逆氮高效利用的玉米新品种选育迫在眉睫。植物应答不同逆境胁迫时，bZIP转录因子发挥着普遍而又关键作用。本文以郑58 自交系为试验材料，选择bZIP基因家族中的亚家族A 和部分B 亚家族成员，共计11 个ZmbZIP作为研究对象，系统研究其应答200 mmol/L NaCl溶液，20% PEG6000，4 ℃低温条件和氮缺乏胁迫条件时的表达，为将来深入剖析这些基因功能提供信息。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本文中以郑58 玉米自交系为试验材料，在开花期，取根、茎、叶、雄花和授粉15 d 的幼穗等不同器官，液氮冷冻处理，-80 ℃超低温冰箱保存。，每份组织样品为3 个独立生物学重复的组织混合样品。

1.2 试验方法

1.2.1 非生物胁迫试验及定量PCR分析

三叶期苗龄的幼苗进行各种逆境胁迫试验，分别在逆境胁迫处理的0、1、6 和24 h，采样进行液氮速冻，超低温冰箱保存，RNA 提取及进行定量PCR分析（引物见表1），非生物胁迫试验及定量PCR 等详细试验内容参考前人研究[25]。

表1 11个ZmbZIP基因的实时定量PCR检测引物Table 1 qRT-PCR primers for expression on analysis of ZmbZIP

1.2.2 bZIP转录因子家族的生物信息学分析

11个玉米bZIP和78个拟南芥AtbZIP的蛋白序列、基因序列和编码序列来源于MaizeGDB（maize genetics and henomics database）和Phytozome v. 9.1（http：//www.phytozome.net/）数据库。11 个ZmbZIP蛋白基本信息利用各种在线常用分析软件，包括在线工具ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam）进行蛋白质基本理化性质预测， Mapinspect 软件绘制其遗传图谱(http：//www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect. html)。 GSDS（http：//gsds. cbi.pku.edu.cn/index.php）软件来绘制ZmbZIP基因结构。MAFFT 软件进行多重蛋白序列比对，利用MEGA 10软件构建进化树。

2 结果与分析

2.1 11个ZmbZIP的生物信息学分析

11 个ZmbZIP基 因 的 各 种 数 据 见 表2。11 个ZmbZIP 蛋白的大小从161 aa（ZmbZIP86）到637 aa（ZmbZIP36），对应分子量从17.87 kDa到67.53 kDa。11个ZmbZIP基因分布在8个不同染色体，各有2个基因分布的染色体为Chr2、Chr5和Chr6，含有1个基因的染色体为Chr1、Chr3、Chr7、Chr8 和Chr9（图1A）。11 个ZmbZIP基因含有内含子数目各异，预示着这些基因进化历程不同（图1B）。典型的bZIP 结构域都存在于ZmbZIP 蛋白N 末端，包括完整的碱式蛋白基序和亮氨酸锌指基序（图1C）。进化树数据显示，11个ZmbZIPs可以划分为3个亚家族，其中亚家族I含有ZmbZIP36，Ⅱ含有3个基因，包括ZmbZIP34、ZmbZIP92和ZmbZIP127，Ⅲ属于AREB 亚家族，包含有AtABF2基因，共包含有5个ZmbZIP基因，表明11个ZmbZIP基因进化历程不同。

表2 11个玉米bZIP基因基本信息Table 2 The basic information of bZIP gene family members in Zea mays

图 1 ZmbZIPs的生物信息学分析Figure 1 The bioinformatic analysis of ZmbZIPs

2.2 ZmbZIP基因在玉米不同组织中的表达谱分析

为了明确ZmbZIP在玉米中的不同组织中的表达水平，对5 种不同组织进行了定量分析。结果如图2所示，所探测的9个ZmbZIP基因的表达模式不同。5 个基因（ZmbZIP14、ZmbZIP34、ZmbZIP84、ZmbZIP92、ZmbZIP119和ZmbZIP127）主要在玉米的幼穗中高表达，其表达量超过其他组织2倍以上，显示这些基因在玉米幼穗形成进程中可能的关键作用。ZmbZIP36和ZmbZIP110在根系器官中表达量最高，而ZmbZIP86同时在玉米根系和雄花器官中表达量最高，分别超过其他组织器官2倍以上，表明这些基因在这些玉米组织发育进程中所发挥的关键作用。ZmbZIP基因不同的表达模式预示着ZmbZIP基因进化和生物学功能的保守性和多样性。

图2 ZmbZIP基因在玉米不同器官（根、茎、叶、雄花和穗）中的表达Figure 2 Expression of ZmbZIP gene in different tissues including root，stem，leaf，tassel，ear and tissue in maize

2.3 各类逆境胁迫调控ZmbZIP基因表达分析

同属这一亚家族的大豆的GmbbZIP1的表达强烈受到ABA、干旱、盐和低温胁迫的诱导[26]。超表达GmbZIP1会改变ABA 或逆境胁迫相关途径基因的表达，提高大豆耐受盐、干旱和低温等胁迫的抗逆水平[26]。由图3 显示，在3 种不同逆境胁迫处理下，8 个ZmbZIP基因表达差异明显。3 种不同逆境胁迫都同时明显诱导ZmbZIP36基因表达，NaCl 溶液胁迫和4 ℃胁迫24 h 时，其表达水平比处理前分别上调9 倍和6 倍以上，PEG6000 胁迫处理1 h 时，其表达水平诱导2倍以上，这些数据暗示ZmbZIP36可能都参与玉米应答这3 种逆境胁迫响应信号途径。NaCl 溶液和低温胁迫明显诱导ZmbZIP86表达，胁迫处理结束时，表达水平比处理前分别上调3倍和11 倍，而PEG6000 明显抑制该基因表达，在胁迫处理结束，其表达量下降了87%左右，表明Zm-bZIP86参与3 种逆境胁迫的分子机制可能不同。NaCl溶液胁迫能明显诱导ZmbZIP34和ZmbZIP110的表达，在胁迫处理24 h时，相比处理前，其表达水平分别上升了至少2倍和5倍以上，同时，高渗和4 ℃低温胁迫显著抑制该基因表达，说明在玉米应答不同逆境胁迫时，这2个基因的分子调控机理各异。3种不同逆境胁迫同时抑制ZmbZIP127表达，在胁迫处理6 h时，其表达水平比处理前下降了80%左右，显示ZmbZIP127参与逆境胁迫响应信号途径时的分子机制与其他的ZmbZIP基因的不同。

图3 高盐、干旱和低温胁迫时ZmbZIP的相对表达量Figure 3 Relative expression levels of ZmbZIPs under 200 mM NaCl，20% PEG6000 and 4 ℃ stress

2.4 氮缺乏胁迫调控ZmbZIP基因表达分析

由图4 可知，不同氮形态缺乏胁迫能明显影响叶片中ZmbZIP基因的表达水平。ZmbZIP14、ZmbZIP34、ZmbZIP84、ZmbZIP92、ZmbZIP110和ZmbZIP127显著的受铵态氮缺乏胁迫诱导，其中ZmbZIP34、ZmbZIP84、ZmbZIP92和ZmbZIP127受到胁迫处理强烈诱导（＞10 倍），分别比处理前上升了256、27、197 和96 倍，而在硝态氮缺乏胁迫下，ZmbZIP34和ZmbZIP92的表达先升后降，在胁迫处理24 h 时，分别比处理前下降了99%和88%，Zm-bZIP84的表达一直下降，表明这4 个基因在玉米抵御硝态氮或铵态氮缺乏胁迫分子生理机制差异。这2 种胁迫处理能明显抑制ZmbZIP36、ZmbZIP86和ZmbZIP119的表达，尤其ZmbZIP86在胁迫处理24 h 时，其表达水平比处理前下降了超过90%。这些数据显示硝态氮或铵态氮缺乏胁迫调控ZmbZIP基因的表达水平，可能在玉米面临氮缺乏胁迫时发挥着不同重要生理生化作用。

图4 叶片中的ZmbZIPs在氮缺乏胁迫时的表达水平Figure 4 Expression levels of ZmbZIPs of leaves under nitrogen stress

由图5 可知，氮缺乏胁迫能显著调控根系ZmbZIP表达水平。ZmbZIP14、ZmbZIP36、ZmbZIP86、ZmbZIP110和ZmbZIP119等5个基因受硝态氮缺乏胁迫明显诱导，其中ZmbZIP14和ZmbZIP36的表达量最高上升了5 倍以上，而铵态氮缺乏胁迫显著地抑制ZmbZIP基因，其中ZmbZIP86和ZmbZIP110的表达下降了90%以上，显示这5个基因在不同氮形态缺乏响应途径中分子生理机制有差异。这2种氮胁迫同时显著抑制ZmbZIP84表达，在胁迫处理24 h时，分别比处理前下降了63%和82%。ZmbZIP127则应答不同形态氮缺乏相反，受铵态氮缺乏胁迫诱导，而硝态氮缺乏胁迫抑制其表达。这些数据显示ZmbZIP基因在玉米根系发育进程中存在不同的分子调控机制。

图5 根中的ZmbZIPs在氮缺乏胁迫时的表达水平Figure 5 Expression levels of ZmbZIPs of roots under nitrogen stress

3 讨论与结论

植物bZIP蛋白家族在植物的生长，以及在抵御各类逆境胁迫途径中发挥着关键的作用。本研究中，通过人为模拟高盐、干旱、低温和缺氮胁迫，以我国玉米骨干自交系郑58为试验材料，系统地分析了11个ZmbZIP基因的响应表达模式。已有大量研究表明bZIP基因广泛受逆境胁迫调控[26]。据报道，在PEG6000 胁迫处理60 h 和96 h 时，ZmbZIP84的表达受到明显抑制，恢复浇水时，该基因表达受诱导而上调，而ZmbZIP34和ZmbZIP92则相反，受PEG6000胁迫诱导而上调，恢复浇水，则表达下调，ZmbZIP119受 盐、PEG 和 温 度 等 胁 迫 的 诱 导[27]。ZmbZIP127在胚的发育进程中受到抑制，而其不同剪切体的表达受内质网胁迫诱导[12]，拟南芥和大豆中的同源基因，AtbZIP60和GmbZIP15也受到干旱和盐胁迫的抑制[28]。利用不同的实验材料，我们的研究结果部分与前人各有异同，比如ZmbZIP92受PEG6000 胁迫的抑制，而受NaCl 胁迫的诱导，ZmbZIP127也受到盐、干旱等胁迫的抑制，而ZmbZIP84并没有受到PEG6000 的明显抑制，同时ZmbZIP127在玉米穗的发育进程中受到明显的诱导，这些表达模式的不同可能来自于试验材料的不同，这在其他研究中也有报道[18]。

在氮缺乏胁迫时，大多数ZmbZIP基因表达水平各异。比如，硝态氮胁迫显著抑制叶片ZmbZIP14的表达，而根系则相反，受到诱导而上调接近10 倍，铵态氮缺乏胁迫下，叶片中的ZmbZIP34、ZmbZIP84和ZmbZIP92受到显著的诱导上调，而在根系这些基因的表达变化不明显，甚至出现显著的下调。根系中ZmbZIP36、ZmbZIP86和ZmbZIP119在硝态氮胁迫1 h时，表现为明显的上调，而叶片中这些基因整个试验过程中都没有表现明显的上调，这些数据表明这些基因在调控玉米根系或叶片中的氮代谢平衡分子机制中发挥着不同的作用。类似的研究在许多植物中也有过报道[29]。

玉米种质资源具有丰富的遗传变异，不同基因型的种质在抗逆方面，包括抗盐、干旱、低温以及氮缺乏胁迫等方面差异显著，充分利用高抗优质玉米种质资源，选育多抗营养高效吸收利用玉米新品种，提高玉米新品种的综合抗性及氮素利用效率，有利于玉米的高产稳产，减少环境污染。传统的常规育种技术周期长，效率低，随着基因工程的成熟，挖掘控制玉米抗逆性的基因资源，解析其分子生理调控机制，利用基因工程等现代生物育种技术来培育高产稳产氮高效吸收利用的玉米新品种成为可能。已知植物bZIP基因家族成员在维持植物的正常生长发育及抗逆等生理活动具有重要的调控作用，本研究利用qRT-PCR 技术检测11 个玉米bZIP基因应答各类逆境胁迫时表达谱，为深入剖析这些基因的功能提供有用信息。