五倍子对凡纳滨对虾生长、抗氧化、非特异性免疫及肠道结构的影响

2023-05-06陈嘉声韦宏杰杨奇慧谭北平陈宇航林华杏

广东海洋大学学报 2023年2期

陈嘉声，韦宏杰，杨奇慧，谭北平，陈宇航，林华杏

（1.广东海洋大学/水产动物营养与饲料实验室，广东湛江 524025；2.广东德宁水产科技有限公司，广东佛山 528399）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生长快，抗逆性强，养殖效益高，是我国广受欢迎的海水养殖对象之一[1-2]。随着对高产量的追求，对虾集约化养殖疾病暴发风险不断增大，病害问题随之成为制约对虾养殖业发展的关键因素之一[3]。因此，寻找新型免疫增强剂成为饲料业的研究热点[4]。

五倍子（Galla chinensis,GC）主要由五倍子蚜寄生在漆树科植物上产生的虫瘿形成，其活性成分由鞣质（又称单宁酸或鞣酸）及没食子酸组成[5]，有提高机体抗氧化能力[6-7]和抗菌抑菌[8]的作用。近年来，五倍子在畜禽饲料中已得到广泛应用，可有效提高养殖畜禽的生长性能、抗氧化能力及肠道消化酶活性[9-11]。在水产动物上亦有报道，五倍子水提取物可抑制凡纳滨对虾体内副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的繁殖[12]；五倍子可提高奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus♀×Oreochromis aureus♂）[13]的生长性能，促进鳙（Aristichthys nobilis）肠道消化酶的分泌，并改善肠道黏膜结构[14]，有效提高草鱼（Ctenopharyngodon idella）的免疫能力[15]。但有关五倍子对凡纳滨对虾生长性能、非特异性免疫和抗氧化指标及肠道组织结构的影响鲜有报道。本研究分析五倍子对凡纳滨对虾幼体生长性能、血清生化指标、肝胰腺抗氧化、非特异性免疫能力及肠道组织结构的影响，为五倍子在对虾配合饲料中的应用提供理论基础和科学依据。

1 材料方法

1.1 实验饲料

基础饲料主要以鱼粉和豆粕等为主要蛋白源，以鱼油等为脂肪源。根据预实验结果，质量分数0.03%的五倍子效果较好，因此在基础饲料中分别添加质量分数0.0%（对照）、0.02%（GC2）和0.04%（GC4）的五倍子（表1），配制成3组等氮等脂实验饲料。各饲料原料粉碎过孔径180 μm 的筛，微量成分采取逐级扩大法添加，利用V 型混合机（M-256，华南理工大学），与大宗原料混匀后，再与鱼油和水充分混匀。用双螺杆制粒机（F-75，华南理工大学）挤压成1.0 mm 和1.5 mm 两种粒径的颗粒饲料，经后熟化、风干后密封放入-20 ℃冰箱中备用。

表1 实验饲料组成及营养水平（干物质基础）Table 1 Composition and nutrient level of experimental feed(dry matter basis) %

1.2 实验设计与饲养管理

实验在广东海洋大学生物研究基地进行，实验前用对照组饲料投喂1 周。选取健康、规格整齐[(0.40±0.00)g]的幼虾480尾，随机放入12只0.3 m3桶（3 组，每组4 个重复，每重复40 尾），分别投喂相应饲料8 周。初次日投喂量为对虾幼体体质量的10%，每天7:00、11:00、17:00、21:00 定量投喂，投喂量根据饲料实际消耗量调整。实验期间每天早上投料前换水1/3，维持水体温度为(30.5±0.8)℃，溶氧不低于6 mg/L，盐度为29～31，氨氮不高于0.02 mg/L，亚硝酸盐质量浓度不高于0.10 mg/L，pH 7.5～8.0。

1.3 样品采集与分析

养殖实验结束后，停饲对虾24 h。对各桶进行计数、称质量，计算存活率（Survival rate，SR，%）、增重率（Weight gain rate，WGR，%）、特定生长率（Specific growth rate，SGR，%/d）、饲料系数（Feed conversion ratio，FCR）等生长性能指标。

式中，Nt和N0分别为终末和初始对虾数量；mt和m0分别为终末和初始对虾总体质量(g)；t为实验时间（d）。

每桶随机取虾25 尾，5 尾对虾用于全虾体成分分析，即水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量测定；取对虾10 尾，从围心腔采血，室温下静置4 h，离心（3 500 r/min，10 min），取上层血清，储存于-80 ℃待用，用于血清生化指标测定；取4尾对虾肠道固定在40 g/L多聚甲醛中，用于制备H.E染色切片。其余对虾迅速取出肝胰腺组织，置于-80°C冰箱保存备用。

全虾常规营养成分参照文献[16]检测，水分测定使用105 ℃常压干燥法(GB5009.4-2016)，粗蛋白含量测定采用杜马斯定氮仪检测（GB5009.5-2016)，粗脂肪测定使用乙醚抽提法（GB5009.6-2016)，粗灰分测定使用550 ℃灼烧法（GB5009.4-2016)。血清总蛋白（TP）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量，谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）；肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LZM）活性及总抗氧化能力（T-AOC）参照南京建成生物工程研究所的试剂盒方法改进。

用DS-Ri2（Nikon，日本）对肠道组织染色切片进行观察和拍照，并通过NIS-Elements D（Version 4.3，Nikon，日本）测量肠壁厚度和绒毛高度。

1.4 数据分析

用统计软件SPSS（Version 20.0，IBM，美国）分析数据，组间差异分析采用单因素方差分析（oneway ANOVA），如各处理间有显著差异(P ＜0.05)，则进行邓肯氏多重检验（Duncan's multiple range test），结果以平均值± 标准差表示。

2 结果分析

2.1 五倍子对凡纳滨对虾生长性能的影响

GC 添加组凡纳滨对虾WGR 和SGR 均显著高于对照组(P ＜0.05)，且FCR 均显著低于对照组(P ＜0.05)（表2）。

表2 饲料中添加五倍子对凡纳滨对虾生长的影响Table 2 Effects of dietary GC supplementation on growth performance for Litopenaeus vannamei

2.2 五倍子对凡纳滨对虾体成分的影响

GC 添加组凡纳滨对虾体蛋白质均显著高于对照组（P ＜0.05），添加GC 对对虾全体水分、粗脂肪及粗灰分均无显著影响（P ＞0.05）（表3）。

表3 五倍子对凡纳滨对虾全虾体成分的影响（干物质基础）Table 3 Effects of dietary GC on body composition for Litopenaeus vannamei(dry matter basis) %

2.3 五倍子对凡纳滨对虾血清生化指标的影响

GC添加组凡纳滨对虾的血清TP含量显著高于对照组（P ＜0.05）；GC4 组血清TG 含量显著低于对照组，而GC2 组则与对照组无显著性差异（P ＞0.05）；GC 添加组的血清TC 含量、AST 及ALT 活性与对照组无显著差异（P ＞0.05）（表4）。

表4 五倍子对凡纳滨对虾血清生化指标的影响Table 4 Effects of dietary GC on serum biochemical indices for Litopenaeus vannamei

2.4 饲料中添加五倍子对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化、非特异性免疫能力的影响

饲料中添加GC 对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化指标影响显著。对照组凡纳滨对虾肝胰腺SOD 及CAT 活性均显著低于添加组（P ＜0.05），且添加组间无显著差异（P ＞0.05）；对照组的肝胰腺T-AOC显著低于GC添加组（P ＜0.05），且GC2组显著高于其余两组（P ＜0.05）(表5)。

表5 五倍子对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化及非特异性免疫的影响Table 5 Effects of dietary GC on antioxidant capacity and non-specific immune-enzyme activities of hepatopancreas for Litopenaeus vannamei

饲料中添加GC 可显著提高凡纳滨对虾非特异性免疫酶活性（P ＜0.05），GC 添加组肝胰腺ACP 及LZM 活性显著高于对照组（P ＜0.05），且添加组间无显著差异（P ＞0.05）；对照组肝胰腺AKP 活性显著低于GC 添加组，其中GC2 组活性最高且显著高于其余两组（P ＜0.05）（表5）。

2.5 五倍子对凡纳滨对虾肠道结构的影响

饲料中添加GC 显著改善了凡纳滨对虾全肠结构（P ＜0.05），GC4组肠壁厚度（IWT）显著高于对照组和GC2 组（P ＜0.05）；对照组绒毛高度（VH）显著低于GC2 组和GC4 组，且添加组间无显著差异（P ＞0.05）（表6）。图1亦有类似结果。

表6 五倍子对凡纳滨对虾全肠结构的影响Table 6 Effects of dietary GC on intestinal morphology for Litopenaeus vannamei μm

图1 饲料中添加五倍子对凡纳滨对虾全肠结构的影响Fig.1 Effects of dietary GC supplementation on intestinal structure for Litopenaeus vannamei

3 讨论

3.1 五倍子对对虾生长性能和体成分的影响

在饲料中添加适量五倍子可改善动物生长状况和提高饲料转化利用率[17]。珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）饲料中添加质量分数1%的五倍子可显著提高其终末体质量（FBW）、WGR 和SGR，显著降低FCR[18]。奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus♀×Oreochromis aureus♂)饲料中添加质量分数0.02%～0.04%五倍子显著提高了FBW、WGR 和SGR[19]。饲料中添加质量分数1.7%五倍子提取物显著提高了断奶仔猪的平均日增重[10]。本研究中，添加质量分数0.02%～0.04%五倍子显著提高了凡纳滨对虾的FBW、WGR和SGR，显著降低FCR，且GC2 和GC4 组的凡纳滨对虾FBW、WGR、SGR 及FCR 无显著差异，表明添加质量分数0.02%～0.04%五倍子对对虾生长无不良影响。其原因可能是，五倍子对肠道的收敛作用使食糜在肠道中的停留时间更长，进而提高了饲料的利用效率，改善了生长性能[17]。

体组成是评价动物营养状况和健康的重要指标之一[19]。水产动物饲料中添加质量分数0.09%的栗木单宁可显著降低其粗脂肪含量，而对水分、粗蛋白和粗灰分则未产生影响[20]。添加质量分数1%～2%缩合单宁对日本花鲈（Lateolabrax japonicus）体成分影响不显著[21]。单宁是五倍子中重要活性物质，本研究中，添加五倍子可显著提高对虾粗蛋白含量，与文献[19-20]不一致，可能与研究物种和单宁含量不同有关。

3.2 五倍子对对虾血清生化指标的影响

血清生化指标可反映动物的营养代谢功能及健康状况[22]。添加质量分数0.02%～0.16%五倍子显著提高了罗非鱼血清血红蛋白含量[13]。五倍子提取物可显著降低高脂肪膳食饲喂大鼠的TC 和TG含量[23]。摄食补充五倍子提取物的肉鸡肝脏中TC含量降低约12%[22]。饲喂五倍子提取物可显著提高仔猪血清TP 含量[25-26]。本研究表明，饲料中添加质量分数0.02%～0.04%五倍子显著提高了对虾血清TP 含量，降低了血清TG 含量，与上述结果相似，表明五倍子提高了对虾对蛋白质的利用和脂质的代谢。AST 与ALT 活性是衡量机体氨基酸代谢水平的重要指标，正常机体血清转氨酶活性会维持在较低的水平，当肝功能异常时AST 和ALT 活性会显著提高[27-28]。本研究表明，添加五倍子对血清AST 和ALT 活性影响不显著，表明质量分数0.2%和0.4%五倍子不会对对虾肝胰腺产生损伤，添加量在合理范围内。

3.3 五倍子对对虾肝胰腺非特异性免疫指标和抗氧化指标的影响

ACP和AKP均属于溶酶体酶，与甲壳动物的免疫功能密不可分[29]。LZM 是水产动物非特异免疫系统的重要组成部分，可通过水解细胞壁导致细菌破裂而亡[30]。饲料中添加质量分数0.10%～0.15%水解单宁显著提高了珍珠龙胆石斑鱼肝脏中AKP和ACP 活性[18]。饲料中添加0.50%～2.00%水解单宁显著提高了鳙血清AKP 和LZM 活性[31]；饲料中添加质量分数2.00%酵提五倍子显著提高了鳙血清LZM 活性[32]。本研究中，添加质量分数0.02%～0.04%五倍子可显著提高凡纳滨对虾血清中ACP、AKP 和LZM 活性，与前人研究结果相似，表明饲料中添加五倍子后，对虾对病原体的消除作用增强，对虾非特异性免疫能力提高。

CAT、SOD 属于机体抗氧化酶，可清除机体内产生的有害物质O2-，从而避免细胞受其损伤[33]。水解单宁可有效提高副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 胁迫后的对虾血清CAT 和SOD活性[34]。珍珠龙胆石斑鱼的饲料中添加1 000～1 500 mg/kg 水解单宁显著提高了肝脏中CAT 和SOD 活性[18]。饲料中添加水提五倍子可提高鳙血清SOD 活性[31]。水提五倍子活性成分主要由单宁组成，体外抗氧化实验证明，水解单宁的抗氧化效果比同浓度的维生素C 和维生素E 更佳[35]，可提高水产动物的抗氧化能力。本研究中添加GC 可显著提高凡纳滨对虾血清的CAT和SOD活性，与其在对虾[34]、珍珠龙胆石斑鱼[18]以及鳙[31]的研究一致，表明五倍子可提高凡纳滨对虾的抗氧化能力。

3.4 五倍子对对虾全肠结构的影响

肠道在机体的营养代谢中有重要作用[36]。饲料成分是影响肠道组织形态的重要因素之一[18]，且消化道形态也会随着营养水平和环境改变[37]，特别是肠道绒毛高度和肌层厚度。研究表明，水解单宁可显著提高石斑鱼肠道绒毛高度[18]。在陆生动物上有较多类似的结果，如肉鸡[37]、仔猪[38-39]和羊[40]。本研究中，添加五倍子显著提高了凡纳滨对虾肠道的绒毛高度和肌层厚度，与前人研究结果基本一致，究其原因可能是水解单宁酸进入肠道后会与肠上皮细胞的蛋白质结合，生成保护肠道黏膜的生物膜，并抑制病原体的入侵，降低肠道损伤发生概率，保护肠道结构同时促进肠道细胞增殖，使肠道绒毛长度和肠壁厚度显著增加[39,41]。