幼年期小鼠双酚F暴露对其行为的影响

梁维凤, 李子木, 常晶晶, 胡 繁

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

双酚A(bisphenol A,BPA)是一种人工合成的化学物质,广泛应用于合成聚碳酸酯以及环氧树脂。作为食品包装的重要单体原料,BPA可以通过物化迁移至食品内容物中,从而进入人体[1]。人类接触BPA的途径主要为饮食和环境,其中饮食暴露超过95%,环境暴露[2]低于5%。文献[2-5]研究表明BPA暴露与不良健康有关,例如低出生体质量、癌症、糖尿病、生殖问题、心血管疾病、肥胖和神经性疾病等。因此,许多国家在一些食品包装中禁止BPA的使用,这也刺激了工业上使用BPA的替代物进行生产,它们与BPA具有相似的化学结构。据了解,目前一共有16种BPA替代物进行工业生产,最主要的包含BPF[6]。其中BPA与双酚F(bisphenol F,BPF)的结构式如图1所示。

图1 双酚A和双酚F的结构简式

BPF也可以作为合成环氧树脂的单体,并且可应用于清漆、黏合剂、塑料、水管、牙科密封剂、食品包装涂料等[7],其中在食品包装中的应用可能给人类健康带来威胁。目前在地表水、沉积物以及室内灰尘中均已发现了BPF的存在[6,8]。在对中国孕妇血清中的双酚物质检测中发现BPF的检出率[9]为20.4%,类似地,在来自西班牙女性乳汁中BPF的检测水平[10]为22%,文献[11]显示在人类尿液中所检测到BPF的浓度、频率与BPA相当。本实验室前期的研究表明,幼年期小鼠1 mg/(kg·d) BPA暴露会扰乱大脑突触可塑性进而影响啮齿类动物的行为[12],这一剂量远低于目前公认最低观察到BPA的不良反应水平剂量50 mg/(kg·d),且低于未观察到啮齿类动物全身不良反应水平剂量[13]5 mg/(kg·d)。此外,根据人类与小鼠的体表面积药理剂量换算,该剂量与人类在日常生活中暴露BPA的水平相当[14]。作为BPA的主要替代物,尽管体内与体外研究已表明BPF的毒性作用[15],然而目前关于BPF对大脑功能的影响研究并不多。本文利用行为学中经典的行为学范式,观察幼年期1 mg/(kg·d)BPF暴露对小鼠行为的影响,这将在工业生产中为BPA替代物的使用选择提供理论依据,并为在食品包装领域BPF的添加标准提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

二甲基亚砜(DMSO)、BPF均购于上海Sigma-Aldrich贸易有限公司;乙醇购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

旷场箱、悬尾箱、强迫游泳水桶以及三箱社交箱来源于中国科学技术大学动物行为研究中心。

1.3 实验方法

1.3.1 动物的处理

12只C57BL/6J雄鼠(21 d)购于北京维通利华实验动物技术有限公司,其中对照组与BPF暴露组各6只,动物饲养于中国科学技术大学动物实验中心。为了模拟人类暴露BPF的途径,本文选择口服饮水的方式暴露BPF,将BPF先溶于DMSO中,再溶于水中,同时对照组小鼠饮用水中加入相同体积的DMSO。其中暴露剂量为1 mg/(kg·d),暴露时间为4周(21～49 d)。由于小鼠不断成长,体质量与饮水量也在不断增加,因此药物暴露期间每隔4 d称量小鼠体质量以及饮水量,及时更换水中BPF的浓度,给药结束后第2天进行行为学检测。

1.3.2 旷场测试

旷场装置是长、宽、高分别为50、50、25 cm的白色无盖长方体,其中旷场底部被分为16个均等的小方格,中间4个小方格为中央区。将每只小鼠从相同位置放入旷场中,任其自由探索5 min,整个期间通过红外摄像机记录下来,且每只小鼠在测试前用75% 酒精擦拭箱体,以免上只小鼠的气味造成干扰。后期使用EthoVision 8.5软件分析小鼠进入中央区的潜伏期、时间、频率以及小鼠的运动总距离。

1.3.3 悬尾测试

在距离小鼠尾巴2 cm处使用胶带将尾巴悬挂在悬尾箱的钩子上(距离地面25 cm),由摄像机记录6 min,后期使用双盲法统计小鼠在后5 min内的总静止时间。

1.3.4 强迫游泳测试

强迫游泳装置为直径15 cm、高30 cm的无盖玻璃圆柱体,其中水深15 cm,温度保持在25 ℃左右。将小鼠单独放入水中游泳6 min并通过摄像机记录下来,后期使用双盲法统计小鼠在后5 min内小鼠的总静止时间。且每只小鼠结束后换干净的水以免前一只小鼠的排泄物、气味等造成干扰。

1.3.5 三箱社交测试

三箱社交箱是长、宽、高分别为60、40、25 cm的白色无盖长方体,且被分割成长、宽、高分别为20、40、25 cm的3个均等隔间,小鼠可以自由穿入3个箱体。小鼠连续适应社交箱3 d,第4天进行测试。测试分为2个阶段:第1阶段测试小鼠的社交能力,在三箱体的左箱体中放入1个金属笼,右箱体对侧放入1只同龄雄鼠(陌生鼠1)于相同的金属笼中,将实验鼠放入中间箱体自由探索10 min;第2阶段测试小鼠的社交新奇能力,将另一只同龄雄鼠(陌生鼠2)放于左箱体的金属笼中,右箱体金属笼中仍为陌生鼠1,任小鼠在三箱体中继续探索10 min,整个测试阶段用摄像机记录下来,且每只小鼠测试前用75%酒精擦拭三箱体以免上只小鼠的气味造成干扰。

使用EthoVision 8.5软件分析小鼠在各个阶段与空金属笼、陌生鼠1、陌生鼠2的嗅探总时间。其中:社交指数为第1阶段测试期间实验小鼠与陌生鼠1、金属笼的嗅探时间之差比两者之和;社交偏好指数为第2阶段测试期间实验小鼠与陌生鼠1、陌生鼠2的嗅探时间之差比两者之和。

1.4 数据分析

采用Prism 5.0对所有行为数据进行t检验分析,其中小鼠体质量与饮水量选择重复测量方差分析,数据均表示为(平均值±标准差),其中:*表示P<0.05时具有统计学差异;**表示P<0.01时具有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 BPF暴露对小鼠体质量及饮水量的影响

小鼠在幼年期暴露BPF期间,每隔4 d称取体质量以及饮水量来观察小鼠的生理状态,如图2所示。由图2a可知,幼年期BPF暴露组与对照组小鼠的成长体质量之间没有差异;由图2b可知,2组小鼠在幼年期药物暴露期间的饮水量之间也没有差异。结果表明,幼年期BPF暴露不会影响小鼠的生理状态。

图2 小鼠在BPF暴露期间的生理状态变化

2.2 BPF暴露对小鼠旷场行为的影响

旷场测试是用来评估啮齿类动物“焦虑样”行为以及基本运动能力的经典行为范式,小鼠在旷场中的表现如图3所示。

图3 小鼠在旷场测试期间的行为表现

由图3a可知,BPF暴露组小鼠在第1次进入中央区的时间显著高于对照组;由图3b可知,BPF暴露组小鼠进入中央区的总时间显著低于对照组;由图3c可知,BPF暴露组小鼠进入中央区的总次数显著低于对照组,即BPF组小鼠在中央区的活跃程度不高,表现出焦虑行为。此外,本文还分析了小鼠在旷场中的总运动距离,统计结果如图3d所示。由图3d可知,两组小鼠之间没有差异,即小鼠的基本运动状况正常。结果表明,幼年期BPF暴露会诱导小鼠的焦虑情绪,且这种焦虑行为与小鼠的运动状况无关。

2.3 BPF暴露对小鼠悬尾行为的影响

悬尾测试示意图如图4a所示,它是基于小鼠处于困境下,想要逃脱而又无法逃脱从而可能放弃挣扎,进入一种抑郁不动的状态,结果如图4b所示。由图4b可知,幼年期BPF暴露显著增加小鼠在悬尾期间的静止时间。

图4 小鼠在悬尾测试期间的行为表现

2.4 BPF暴露对小鼠强迫游泳行为的影响

强迫游泳测试的示意图如图5a所示,其原理与悬尾测试的原理相同。

小鼠在强迫游泳的总静止时间如图5b所示,从图5b可以看出,BPF暴露同样会增加小鼠在强迫游泳期间的总静止时间,这与悬尾的结果是一致的。结果表明幼年期BPF暴露会诱导小鼠的抑郁情绪。

图5 小鼠在强迫游泳测试期间的行为表现

2.5 BPF暴露对小鼠三箱社交行为的影响

三箱社交测试第1阶段用来评估小鼠的社会交往能力,小鼠在三箱社交测试期间的行为表现如图6所示。

图6 小鼠在三箱社交测试期间的行为表现

由图6a可知,BPF暴露小鼠与陌生鼠1的嗅探时间显著低于对照组,即BPF暴露组小鼠不愿意与陌生鼠交流。由于不同小鼠的活泼好动程度不同,为了消除这种个体差异性,本文借鉴前人的分析方法分析小鼠的社交偏好指数,分析结果如图6b所示,该结果与嗅探时间分析的结果是一致的,即BPF暴露小鼠的社交偏好指数也显著低于对照组。

三箱社交测试第2阶段用来评估小鼠的社交偏好能力,即小鼠是否愿意与新的小鼠交流。从图6c可以看出,BPF暴露组小鼠与陌上鼠2的嗅探时间与对照组相比没有差异。

为了消除小鼠个体差异,本文分析了小鼠的社交新奇偏好指数,如图6d所示,结果发现,两组小鼠之间也没有显著差异。结果表明幼年期BPF暴露会损害小鼠的社交能力,而对社交新奇能力没有影响,即小鼠的探索能力不会因BPF暴露而改变。

3 讨 论

近年来,情绪障碍患者逐年增加,很多人把其归因于工作和生活压力,而忽略了源于饮食、环境等潜在危害。尽管大量研究已表明BPA的毒性作用且其已被限制使用,然而BPF作为BPA的主要替代物,它的研究仍未完全展开。此外,幼年期作为大脑发育关键期,尽管激素水平稳定,但神经系统仍易受到外界环境物质的干扰[16]。因此,本文以幼年期为时间窗口,观察BPF暴露对小鼠情绪以及社交行为的影响。

本文首先分析了小鼠在幼年期经BPF暴露对其体质量及饮水量的影响,结果表明BPF暴露不会影响小鼠的正常生理状态。旷场测试结果显示BPF暴露显著减弱小鼠在中央区的活动程度,诱导小鼠产生焦虑行为。这一结果与先前在围产期[17]、青春期[18]以及成年期[19]暴露BPA对啮齿类动物的研究一致。文献[20]研究表明尿液中BPA浓度与男孩的焦虑抑郁状态呈正相关。然而,目前关于BPF对人类流行病学研究很少。抑郁症以持续的情绪低落为主要症状,是目前世界上最常见的神经性疾病之一。本文以悬尾和强迫游泳2种经典的行为范式对BPF暴露小鼠进行评估,行为结果表明两者在小鼠处于困境下放弃挣扎、静止不动的时间是一致的,即BPF暴露诱导小鼠产生抑郁行为。这与BPA的结果类似,且无论是对动物还是人类的研究中,BPA诱导产生的异常情绪中焦虑与抑郁行为一般同时存在[16-19]。此外,文献[21]发现在妊娠期通过口服暴露10 mg/(kg·d) BPF诱导子代小鼠的焦虑和抑郁行为,这与本文在幼年期以较低剂量暴露的结果是一致的。

社交是动物本质的内在需求,是不同个体之间相互来往的社会活动。焦虑抑郁状态下可能伴随着社交障碍,这些行为相关的脑区之间有重叠但不完全相同。为了评估BPF暴露对社交行为的影响,本文选择经典行为范式三箱社交。结果表明BPF暴露损害小鼠的社交能力而对社交新奇能力没有影响。

文献[22]研究发现BPA暴露影响4岁儿童的社交能力,且每当BPA浓度增加2倍,社交沟通障碍增加11.8%。文献[23]以小鼠为模型,发现BPA暴露引起小鼠社交缺陷,这与本文BPF暴露具有相似的结果。结果表明,BPF作为BPA的替代物,长期暴露似乎与BPA具有相似的行为损伤,长期BPF暴露对人类的潜在危害令人担忧。

BPF与BPA暴露这种行为相似的结果与它们在大脑中发挥的类雌激素作用有关。文献[24]以斑马鱼为模型,研究了BPA及其替代物的雌激素活性,发现BPA的雌激素活性与BPF相当;文献[25]报道BPF的雌激素活性高于BPA,这种结果的不一致性可能与双酚物质的暴露剂量和时期不同有关;文献[26]在妊娠期以10 μg/(kg·d) 暴露BPA、BPS以及BPF,发现双酚物质暴露组均降低大鼠前额叶皮层5α-还原酶的mRNA水平,影响多巴胺、5-羟色胺相关基因表达。情绪以及社交行为的表达受到来自大脑前额叶皮层的调控[27-28],而BPF暴露诱导小鼠行为的异常表达可能与前额叶功能发挥异常有关。未来将继续探究双酚物质对神经系统的影响及可能的生理机制,为工业上以双酚物质为原料的生产,尤其是在食品包装领域的应用提供理论支持。

4 结 论

本文研究发现,幼年期1 mg/(kg·d) BPF暴露可诱导小鼠的焦虑行为、抑郁行为,减弱小鼠的社会交往能力,而对新奇小鼠的探索性以及小鼠本身的成长生理状态没有影响。前额叶与杏仁核是调控情绪以及社交行为的关键脑区,将进一步探讨BPF可能影响这些脑区功能的生理机制。此外,BPF作为BPA的主要替代物,在工业上的生产应用仍需谨慎,且BPF对大脑发育关键期的毒性作用应引起重视。