中华草龟、中华花龟及其杂种F1 代形态差异分析

贺刚，徐金根，何力，吴斌，方春林，喻亚丽，费春平

（1.江西省水产科学研究所，江西 南昌 330039；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 武汉 430223；3.九江市水产科学研究所，江西 九江 332099；4.江西金龟王实业有限责任公司，江西 上饶 334400）

中华草龟（Chinemys reevesii）隶属龟鳖目（Testudinate）龟科（Emydidae）乌龟属（Chinemys），俗称乌龟、墨龟，泥龟，是常见的养殖龟种之一，在中国分布广泛[1]。中华花龟（Ocadia sinensis）隶属龟科花龟属，俗称花龟、珍珠龟，分布在中国南方地区[2]。两者都具很高药用、食用和观赏价值。随着龟类野生资源持续减少，而繁养殖规模逐年扩大，导致养殖过程中种质退化、畸形率高、性成熟延迟、饵料系数高等现象频繁发生。因此，开展新养殖品种的繁养殖是解决龟类种质的有效途径。近年来，已发现20多种杂交龟，新品种数量不断增加，但报道甚少，仅见金石杂交龟[黄喉拟水龟（Mauremys mutica♀）与三线闭壳龟（Cuora trifasciata）][3]和乌花杂交龟[中华草龟（♀）与中华花龟（）][4]。迄今，已对龟鳖类形态习性[5]、生长繁育[6,7]和种群分化[8]等进行了诸多研究。

为获得适于养殖推广的新品系，由中华草龟（♀）×中华花龟（）杂交后培育的品种称为乌花杂龟，具有品相好、生长快、价值高等优点[9]。近年生产实践证明，杂种龟的生长和抗逆性明显提高，现

已经进行了大规模养殖，具有良好的经济价值。杂种及其亲本的形态、体色、花纹等具有一定相似性，从系统形态学鉴定杂种龟更为直观。聚类分析、判别分析及主成分分析是水生动物形态差异分析的

常用方法[10-12]。本实验采用聚类分析、判别分析和主成分分析对中华草龟、中华花龟及其杂种的形态进行综合分析，探究杂交种与亲本间的亲缘关系，建立相应的形态鉴别方法，为龟类杂交育种和生产实践提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用龟来自江西省乌龟良种场，随机选择6月龄的中华草龟、中华花龟及杂种F1代各60 只，共180 只，其背面和腹面见图1，样本体质量、背甲长等信息详见表1。

图1 3 种龟的形态性状Fig.1 Morphological demonstration of three species of tortoises

表1 3 种龟的样本信息Tab.1 Samples date of three species of tortoises

1.2 测定方法

用精确度0.01 g 电子天平称量体质量（Y），用精确度0.01 cm 游标卡尺测量背甲长（X1）、背甲宽（X2）、壳高（X3）、腹甲长（X4）、腹甲后半部长（X5）、腹甲前半部宽（X6）、腹甲后半部前宽（X7）、腹甲后半部后宽（X8）、甲桥长（X9）、喉盾宽（X10）、喉盾缝长（X11）、肱盾缝长（X12）、胸盾缝长（X13）、腹盾缝长（X14）、股盾缝长（X15）和肛盾缝长（X16）等17 项形态性状。

1.3 数据处理

所测可量性状数据都除以背甲长进行校正，以消除形态大小对测量结果的影响，所得参数经对数转换以除去异速生长产生的差异。采用Excel 和SPSS16.0 软件处理数据，采用聚类分析、主成分分析、判别分析3 种多元分析方法对不同种龟及其杂交种进行形态差异分析。

采用欧氏距离法进行聚类分析。判别分析采用逐步判别法分析，选取对判别过程贡献大的参数建立3 种龟的群体性状判别函数。主成分分析是将多个形态指标综合成少数或几个因子，用以说明不同种简单差异大小。

2 结果与分析

2.1 可数性状比较

校正后的中华草龟、中华花龟和杂种龟群体各形态性状比例参数见表2，从形态上看，背甲宽/背甲长、壳高/背甲长、腹甲长/背甲长、腹甲后半部长/背甲长、腹甲前半部宽/背甲长、喉盾宽/背甲长、喉盾缝长/背甲长表现出中华草龟>杂种龟>中华花龟，在体型特征上存在差异。

表2 3 种龟可量比例性状均值及标准差Tab.2 Overall mean and standard deviation of relative values of meristic characters of two species of tortoises and their hybrid

2.2 聚类分析

3 种龟群体可量比例性状经对数转化形态数据见表3，基于欧氏距离进行聚类分析，建立亲缘关系树如图2。中华草龟和杂种龟在形态上最为接近，聚为一组，而中华花龟与草龟、杂种龟形态差异较大。

表3 3 种龟群体的形态距离（欧氏距离）Tab.3 Morphological distances calculated by cluster analysis among three species of tortoises

图2 3 种龟群体的形态聚类分析Fig.2 Morphological cluster plot of three species of tortoises

2.3 判别分析

采用逐步判别分析，从草龟、花龟及杂种龟的15 个比例参数筛选出有显著性贡献的10 个变量：背甲宽/背甲长（X1）、壳高/背甲长（X2）、腹甲前半部宽/背甲长（X3）、腹甲后半部前宽/背甲长（X4）、腹甲后半部后宽/背甲长（X5）、甲桥长/背甲长（X6）、喉盾宽/背甲长（X7）、喉盾缝长/背甲长（X8）、腹盾缝长/背甲长（X9）和肛盾缝长/背甲长（X10）。当判别函数含有以上10 个变量时，建立的判别函数效果良好，所得判别公式如下：

中华草龟=783.936X1＋666.790X2＋117.351X3－108.260X4－185.567X5＋714.807X6＋593.752X7＋508.921X8＋71.984X9－14.342X10－665.829

中华花龟=857.281X1＋471.441X2＋59.295X3－132.825X4－64.874X5＋684.733X6＋440.335X7＋306.659X8＋172.282X9－19.938X10－575.971

杂种龟=825.599X1＋536.489X2＋119.892X3－170.109X4－113.135X5＋775.956X6＋480.404X7＋456.357X8＋149.029X9－60.558X10－635.052

将3 种龟的10 个比例性状数值带入各判别函数中，以所得最大函数值来判别该龟所属类别。根据判别函数对所有观测样本进行预测分类，综合判别准确率达到93.3%（表4）。60 只中华草龟代入判别函数回代分类，与实际相符的58 只，2 只错判为杂种龟，判别准确率为96.7%；60 只中华花龟回代分类，与实际相符的57 只，3 只错判为杂种龟，判别准确率为95.0%；60 只杂种龟回代分类，与实际相符的53 只，1 只错判为中华草龟，6 只错判为中华花龟，判别准确率为88.3%。

表4 3 种龟判别分析后的结果Tab.4 The results of discrimination analysis of three species of tortoises

2.4 主成分分析

对草龟、花龟及杂种龟群体的可量比例参数数据进行主成分分析，共提取8 个主成分，累计贡献率达85.05%。其中前4 个主成分的贡献率分别为33.81%、11.01%、10.25%和8.13%，累计贡献率达63.20%，这4 个主成分覆盖群体总变异的绝大部分，说明几个相互独立因子可以分析3 种龟的形态差异所隐含的信息。

3 种龟形态性状的特征值、贡献率和累计贡献率见表5。对第一成分起主要作用的是：喉盾缝长/背甲长、喉盾宽/背甲长、壳高/背甲长、腹甲后半部前宽/背甲长、股盾缝长/背甲长、腹甲前半部宽/背甲长和腹甲长/背甲长，其中喉盾缝长、喉盾宽、壳高对主成分1 有主要贡献（>0.700）；对第二成分起主要作用的是：腹甲后半部后宽/背甲长、肛盾缝长/背甲长、背甲宽/背甲长和腹甲后半部长/背甲长，其中腹甲后半部后宽对主成分2 有主要贡献（>0.700）；对第三成分起主要作用的是：甲桥长/背甲长、腹盾缝长/背甲长和腹甲长/背甲长，其中甲桥长、腹甲缝长对主成分3 有主要贡献。

从3 种龟的散点图分布情况（图3）可以看出种间形态差异较大。杂种龟与中华草龟、中华花龟均有较大的重叠，在性状特征上与亲本均接近。中华草龟与中华花龟间没有重叠。

图3 3 种龟的主成分分析图Fig.3 Scatter plots of principle components of two species of tortoises and their hybrid

3 讨论

3.1 形态差异分析

杂交优势表现为杂种生存及繁殖能力的提高，这类在生物进化学才有适应意义。国内外有很多龟鳖类杂交优势育种和利用的报道，并取得一定的成果。以洞庭湖鳖（♀）和黄河鳖（）杂交并经过5 代群体选育的绿卡鳖，生长速度大于黄河鳖，而在稚幼阶段明显优于其两亲本[13]。英明中华鳖是采用连续杂交技术对不同品系中华鳖进行遗传选育而得到的新品种，杂交后代优势明显[14]。潘志等[15]对外来引进的刺鳖（Apalone spinifera）和珍珠鳖（Apalone ferox）杂交子代的形态与生长进行比较，结果表明，与亲本相比，杂交子代摄食能力强，养殖成活率较高，具有较明显的杂种优势。至今，发现龟类杂交已有30 多种[16]，但有关报道甚少。黄喉拟水龟（♀）与三线闭壳龟（）的杂种后代形态保留了双亲本独有特征，但在形态特征上接近母本黄喉拟水龟，在背甲纹路、腹甲黑斑、四肢和尾腹面的皮肤颜色及起点位置等比例性状存在差异[3]。

本研究表明，杂种龟在个体形状、体色条纹、生长速度等方面遗传了中华草龟和中华花龟双亲的特征，也有显著的差异。主要表现在背甲颜色、棱突，皮肤条纹与亲本对比差异强烈，在可数性状方面，杂交龟与亲本无显著差异。在可量比例性状上，部分指标反映中华草龟>杂种龟>中华花龟，在体型特征上存在差异。聚类分析显示，在整体形态上，杂交龟介于亲本之间，但更接近母本中华草龟。判别分析可见，所得最大函数值来判别龟属，综合判别准确率达到93.3%，可以较为准确判别中华草龟、中华花龟及其杂种。由图3 可知，3 种龟形态差异程度，杂种龟与亲本重叠部分多，在形态特征上与亲本均接近，而中华草龟与中华花龟间没有重叠部分。本研究中，三种分析方法均得出了相同的结论。生物形态是物种对环境适应的表现，也是物种多个性状的集合，一般受遗传因子和环境因素的共同作用[10,17]。

3.2 聚类分析、判别分析和主成分分析在龟类保护中的应用

形态特征是物种间差异的直接体现，也是相似物种初步鉴别依据。不同物种的杂交后代通常表现两个亲本的中间态[18-20]，可数和可量性状在形态学标记中尤为重要。本实验测量了杂交龟及其亲本的形态特征，通过聚类分析、判别分析和主成分分析等统计学方法处理分析，结果显示杂交龟保留亲本双方的性状特征，对现有龟类杂交种资资源进行评估，为龟类种质资源保护和杂交选育提供理论依据。

在可量性状比值方面，背甲宽/背甲长、壳高/背甲长、腹甲长/背甲长、腹甲后半部长/背甲长和腹甲前半部宽/背甲长等体型特征上存在差异，且杂种龟介于亲本之间，在亲本性状表现具有偏向性。推测来自亲本的遗传因子在杂交子代性状表达上具有喜好选择性。

聚类分析从染色体、蛋白质和DNA 分子等不同水平进行龟鳖类的系统进化关系分析，得出不同的聚类分析结果。黄雪贞等[21]采用RAPD 技术分析了中华鳖日本群体（♀）×黄河群体（）的杂交子代的遗传多样性，显示杂交子代遗传多样性优于亲代。贺刚等[22]利用线粒体DNA 的细胞色素b 基因分析表明，杂交龟与草龟遗传距离最小，与花龟次之，与条颈龟（Cyclemys tcheponensis）和果龟（Notochelys platynota）最大。本实验从形态学角度探究了杂交龟与亲本间的遗传变异关系，发现杂种龟与母本中华草龟形态距离更近，推测来自母本的遗传因子在性状表达调控方面更具优势。

判别分析是水生动物常用的鉴别方法。通过建立判别函数和相应的测量指标，使函数的形式较为简便，且获得更好的判别效果[23-25]。梁宏伟等[26]通过逐步判别法建立了淮河、黄河和日本3 个品系中华鳖的判别函数。结果显示淮河品系中华鳖雌雄判别准确率较高，综合判别率为88.3%，判别效果最好；而日本品系中华鳖雌雄性别判别准确率相对较低。杨贵强等[27]对安徽黄缘闭壳龟、台湾黄缘闭壳龟和黄喉拟水龟3 种稚龟进行了判别分析，得出贡献较大的主要变量有腹甲宽／背甲长、甲桥长／背甲长、肱盾宽／背甲长、肱盾缝长／背甲长和胸盾缝长／背甲长5 个参数可作为鉴别上述3 种观赏稚龟的主要客观依据。本实验采用了逐步判别分析的方法，按照入选性状的差异大小逐步进行判别，最后选取了10 个变量，综合判别准确率达到93.3%，贡献较大的变量主要集中在龟的腹部和体宽，判别效果良好。构建的判别公式提供了一种简单易行的判别草龟、花龟及其杂种种质的方法。

主成分分析是将多个观察指标简化为少数方差贡献率较大综合因子（主成分）的方法，通过主成分分析图概括不同群体间的形态差异[28]。本研究对3 种龟的15 个比例性状进行主成分分析，对第一成分起主要作用的是喉盾缝长、喉盾宽、壳高，对第二成分起主要作用的是腹甲后半部后宽，对第三成分起主要作用的是甲桥长、腹甲缝长。3 种龟的形态差异主要体现在腹甲体型因子上。

综上所述，龟类的外部形态测量为杂种鉴定提供了一个简洁高效的途径。但是，要全面评价杂交种及亲本遗传关系，还应在生理生化、分子标记等水平上深入研究。