温度、氨氮和亚硝氮对西伯利亚鲟胚胎孵化的联合影响效应

贾文飞　易雨君

摘要：鲟作为具有重要生态和经济价值的水生生物，在气候变暖和人类活动的影响下其自然繁育面临巨大威胁。为了探究环境因子对鲟早期胚胎发育的影响，采用3因子3水平的Box-Behnken设计和响应曲面分析法，开展了温度（14～22℃）、氨氮（0.05～0.15 mg/L）和亚硝氮（0.05～0.25 mg/L）对西伯利亚鲟（Acipenser baerii）早期胚胎发育的联合影响效应研究，旨在建立温度、氨氮和亚硝氮与西伯利亚鲟胚胎孵化率的定量关系，并通过多元回归得出温度、氨氮和亚硝氮的最佳组合。结果表明，随着温度的升高，西伯利亚鲟胚胎孵化率呈现先升高后降低的趋势，随着氨氮和亚硝氮浓度的降低，西伯利亚鲟胚胎孵化率逐渐升高。水温与氨氮的联合效应对鲟胚胎孵化率的影响呈显著水平（P<0.05），而水温与亚硝氮的联合效应以及氨氮与亚硝氮的联合效应对鲟胚胎孵化率的影响不显著（P>0.05）。建立的西伯利亚鲟胚胎孵化率模型方程的相关系数为0.9832，校正相关系数为0.9616。通过模型优化得出西伯利亚鲟胚胎在温度18℃，氨氮浓度低于0.08 mg/L和亚硝氮浓度低于0.13 mg/L条件下西伯利亚鲟胚胎的孵化率最高，达到90%以上。研究结果为西伯利亚鲟的人工繁殖和自然资源保护提供了理论依据。

关键词：西伯利亚鲟胚胎；温度；氨氮；亚硝氮；孵化率

中图分类号：S965.215        文献标志码：A        文章编号：1674-3075（2023）06-0072-07

鱼类产卵地的环境条件与它们的繁殖活动，甚至种群的延续息息相关。鱼类胚胎孵化过程会发生一系列生理生化反应，这些过程会受到水体中各种环境因子包括温度（Kappenman et al，2009; Güralp et al，2017）、盐度（Bian et al，2016）、pH（Ko et al，2014）、氨氮（Chen et al，2013; El-Greisy et al，2016）、亚硝氮（Kroupova et al，2010; 韩枫等，2016）、溶解氧（Yang et al，2015）等的影响。水温通过影响受精卵孵化酶活性进而影响鱼卵孵化（Kappenman et al，2009），水温过高会破坏酶的活性，过低则抑制酶的活性（Bian et al，2016），且不同鱼类胚胎发育所需的最适宜水温范围各不相同（Güralp et al，2017）。无机氮主要以非离子氨和亚硝氮的形式对胚胎的生长和代谢产生较大的毒害作用。不同物种对氨氮和亚硝氮的适应性也有差异（Chen et al，2013），且水生生物的不同生命阶段也会表现出不同的敏感性（Harcke & Daniels，1999; Chen et al，2012）。此外，多个环境因子对胚胎孵化影响的联合效应也是显著的（彭俊，2011; 韩枫等，2016）。

鲟是起源最早的脊椎动物类群之一，具有重要的生态和经济价值（Webb & Doroshov，2011; 班文波等，2016）。近年来，由于全球气候变化引起的水温异常、水利设施的建设和水体的富营养化，导致鲟自然栖息的生境条件恶化，一些物种（如中华鲟Acipenser sinensis）已濒临灭绝（惠二青等，2018; 陶雨薇等，2018；Shen et al，2018）。了解环境因素对鲟胚胎发育的影响对鲟资源的保护具有重要意义。

目前关于鲟胚胎发育与环境因子的响应关系研究，主要集中在温度对其的影响方面（Park et al，2013；Kim et al，2018）。Park等（2013）通过孵化试验确定了最适宜西伯利亚鲟（Acipenser baerii）胚胎孵化的水温为20℃左右，水温低于20℃，受精卵发育速度较慢，水温超过24℃会造成受精卵死亡；Kim等（2018）发现俄罗斯鲟（Acipenser gueldenstaedti）胚胎的适宜孵化水温与西伯利亚鲟相近；也有研究通过对天然产卵场的水质调查来获取鲟的适宜生存环境（王彩理等，2002）。然而这些研究没有综合考虑因子之间的互作性，未能准确反映水生生物对多个环境因子胁迫的响应，本研究针对水温、氨氮和亚硝氮，采用响应曲面法和Box-Behnken设计了系列试验，对多因子影响下的西伯利亚鲟胚胎孵化进行了分析，以期构建温度、氨氮和亚硝氮对其胚胎孵化率的定量关系，得出孵化的最佳水温、氨氮、亚硝氮条件，量化各因子及因子之间的交互影响，为西伯利亚鲟的人工繁殖和自然资源保护提供理论依据。

1   材料与方法

1.1   试验材料

西伯利亚鲟受精卵来自北京燕山长城金鳟养殖基地，通过人工受精的方式获得（Kim et al，2018）。为了消除个体差异对试验结果的影响，卵子和精子分别取自3组性腺发育良好的西伯利亚鲟，采用腹部挤压法，将卵子挤入塑料盆中，再快速取适量精子与卵子混合，并用玻璃棒搅动3 min实现受精。受精卵通过石灰法处理去除粘性（张耀武等，2017），并用清水冲洗备用。

1.2   试验设计

本研究采用响应曲面法分析温度、氨氮和亚硝氮对西伯利亚鲟胚胎孵化的影响。响应曲面法是用来研究不同变量间相互作用的数学统计方法，该方法能够以最少的试验量充分反映变量之间的响应关系（Ahmad et al，2005），并找到最合适的条件，进行较准确的响应预测（Wang et al，2014; 吴富华等，2016）。本研究采用3因子3水平的Box-Behnken响应曲面设计，试验因子为水温、氨氮、亚硝氮，分别以T、A、N表示，孵化率用HR表示。根据预试验结果设置水温为14～22℃，氨氮浓度为0.05～0.15 mg/L，亚硝氮浓度为0.05～0.25 mg/L。整个试验包括17个试验点，每个试验点设置3个重复，各试验点的次序随机安排，因子组合如表1所示。

试验母液分别用分析纯NH4Cl和NaNO2与超纯水配制而成（Chen et al，2013），试验液由母液经曝气脱氯后的自来水稀释而成，试验水温通过水温控制器调节，依据西伯利亚鲟胚胎孵化所需的适宜水质条件（Gisbert & Williot，2002），将水体溶解氧设为9.13～9.58 mg/L，pH为7.89～8.35，其他水质指标通过YSI水质仪检测以确保不同处理水平保持一致。试验容器为高30 cm，直径20 cm的圆塑料桶，圆桶用高锰酸钾液消毒处理，试验用水量为2 L，试验期间每8 h更换1次以保证水质稳定（图1）。每个组次培养50粒成功受精的鱼卵，试验过程中通过气石使受精卵在水中保持翻滚，每天定时取出死亡的受精卵，每4 h观察胚胎发育情况并记录。

2   结果与分析

2.1   ANOVA结果

西伯利亚鲟胚胎孵化的试验结果如表2所示，通过Design-Expert 10.0软件对表1和表2中结果进行多元回归分析，建立了水温、氨氮和亚硝氮对鲟胚胎孵化率影响的回归方程：

西伯利亚鲟胚胎孵化率响应曲面模型的ANOVA方差分析结果（表3）表明，模型的P值<0.0001，说明响应面回归模型达到了极显著水平，失拟项P值为0.798，失拟项不显著，表明模型能够充分说明因子与响应变量之间的函数关系，所建立的孵化率模型有效。模型的拟合度通过相关系数R2和校准相关系数R2检验，R2超过0.90表明模型拟合良好。该回归模型相关系数R2=0.9832，表明孵化率98.32 %的变量可以通过所有自变量的线性、二次和交互影响解释，校准相关系数R2=0.9616，表明模型拟合度良好。变异系数CV值相对较低（12.80 %），表明试验具有良好的精度和可靠性。模型精密度可达到19.315，满足要求。从图2中也可以看出，模型的预测值和实际值分布在一条直线上，表明模型的精密度和可信度均在可行的范围内，因此可用该回归方程分析和预测水温、氨氮和亚硝氮对西伯利亚鲟孵化的影响。

对回归模型系数估计的结果见表4，表明水温和氨氮的一次效应，氨氮的二次效应对西伯利亚鲟胚胎孵化率的影响均极显著（P<0.001），亚硝氮的一次效应，水温与氨氮的交互效应，水温和亚硝氮的二次效应对西伯利亚鲟胚胎孵化率的影响均显著（P<0.05），而水温与亚硝氮的交互效应以及氨氮与亚硝氮的交互效应对西伯利亚鲟胚胎孵化率的影响不显著（P>0.05）。氨氮的单因子影响最显著（P<0.0001），其次是水温（P<0.0004），最后是亚硝氮（P<0.007）。

2.2   响应曲面分析

当亚硝氮浓度固定在0.15 mg/L时，不同水温和氨氮对西伯利亚鲟胚胎孵化的影响如图3-a，3-b所示。随着水温和氨氮浓度的上升，孵化率呈现先增加到一定程度后开始降低的趋势，水温和氨氮对孵化的影响非常显著，在水温为11.8～18.9℃，氨氮浓度低于0.09 mg/L时，孵化率可达到80%以上。

当氨氮浓度固定在0.10 mg/L时，不同水温和亚硝氮对西伯利亚鲟胚胎孵化的影响如图3-c，3-d所示。随着水温和亚硝氮的上升，孵化率同样呈现先增加到一定程度后开始降低，水温和亚硝氮对孵化的影响非常显著，且水温的影响程度更大。当水温为14～18℃，亚硝氮浓度低于0.16 mg/L时，孵化率可达到80%以上。

当水温固定在18 ℃时，不同氨氮和亚硝氮对西伯利亚鲟胚胎孵化的影响如图3-e，3-f所示。随着氨氮和亚硝氮的上升，孵化率先增加到一定程度后开始降低，相比于亚硝氮，氨氮对孵化的影响程度更大。当氨氮浓度低于0.096 mg/L，亚硝氮浓度低于0.19 mg/L时，孵化率可达到80%以上。

2.3   模型优化

本研究采用响应曲面法中的数值优化来获取最佳孵化组合，数值优化通过确定输入变量（温度、氨氮和亚硝氮）的组合，在期望的约束下优化响应（孵化率）。本研究主要目标是最大化西伯利亚鲟的孵化率，有研究表明水温与鱼类胚胎的发育速率有显著的关系，温度越高胚胎发育速率越快（Park et al，2013; Wang et al，2014; Kim et al，2018），即高温条件下胚胎越早发育到环境耐受性更高的仔鱼阶段，因此将水温的期望设置为最大。通过数值优化最终得到最佳条件为：水温18.0℃，氨氮浓度低于 0.08 mg/L，亚硝氮浓度低于 0.13 mg/L，最大孵化率可达到91.2%。

3   讨论

温度是影响水生生物胚胎发育的重要因素之一。本研究中西伯利亚鲟胚胎的孵化率与水温存在显著的相关关系，温度的一次效应和二次效应与孵化率具有显著正相关（P<0.05），表明随着温度的升高，西伯利亚鲟胚胎的孵化率呈现先升高后降低的趋势，这一现象同样出现在其他鲟的研究中。Park等（2013）的试验研究表明，水温为18～20℃时最适宜西伯利亚鲟孵化，此水温条件下胚胎发育速率较高，同时也保证了孵化率水平较高。当水温超过20℃，西伯利亚鲟的孵化率会受到影响而降低，水温到达24℃受精卵会大量死亡。Kim等（2018）对俄罗斯鲟受精卵孵化受水温影响的试验研究得到了一致的结论。王彩理等（2002）对于中华鲟产卵场的环境调查显示，水温在17～21℃时中华鲟受精卵孵化率较高，超出适宜水温，孵化率将大大降低，且畸形率也会增加。本研究发现西伯利亚鲟胚胎在14℃、18℃和22℃温度下发育正常，随着温度的升高，孵化速率先升高后降低，在18℃时达到最大值。有研究称水温通过影响孵化酶的活力进而影响胚胎的发育速度（Kim et al，2018）。虽然水温会影响鲟的孵化质量（Park et al，2013；Kim et al，2018），但本研究中不同水温下成功孵化的幼鱼个体之间无显著差异。在保证孵化质量的前提下建议采用较高的温度进行的孵化，受精卵可尽早发育至适应能力更强的仔鱼阶段（Gisbert & Williot，2002；庄平等，2009）。

已有研究证实鱼类的早期发育对氨氮和亚硝氮较为敏感（Chen et al，2013; Shyam & Nakul，2013; 韩枫等，2016），本研究结果表明，氨氮和亚硝氮均显著影响西伯利亚鲟孵化率（P<0.05），随着氨氮和亚硝氮浓度的升高西伯利亚鲟胚胎的孵化率随之降低。目前关于氨氮和亚硝氮对鲟胚胎孵化影响的试验性研究鲜有报道，主要的方法是通过产卵场的水质调查来了解鲟孵化的水质需求（战培荣等，2002；胡小琴等，2009）。由于生活污水的排放导致葛洲坝坝下中华鲟产卵场水体氨氮浓度升高（胡小琴等，2009），结合本研究结果，为保证中华鲟的成功繁殖，建议对该区域氨氮进行监测并采取相应措施进行管理。战培荣等（2002）对黑龙江段水质的监测结果显示鲟鳇鱼产卵场氨氮浓度平均值约为0.011 mg/L，亚硝氮浓度平均值为0.02 mg/L。不同物种对亚硝氮的敏感性存在差异，Kroupova 等（2010）得到鲤（Cyprinus carpio）胚胎孵化的无影响亚硝氮浓度为7.0 mg/L，更高浓度的亚硝氮会一定程度上延缓鲤胚胎的发育速度。虹鳟（Oncorhynchus mykiss）胚胎孵化的无影响亚硝氮浓度为0.01 mg/L，远远低于鲤（Kroupova et al，2008）。值得注意的是，相较于自然条件，室内孵化系统中水质更加稳定，胚胎对氨氮和亚硝氮的耐受性相对较高（Kamstra et al，1996）。

环境因子对水生生物胚胎发育的交互影响因物种、影响因子和发育阶段而存在差异（Wang et al，2012; Ko et al，2014; Wang et al，2015; 吴富华等，2016）。本研究结果显示，水温和氨氮的交互作用会对西伯利亚鲟的孵化产生显著影响（P<0.05，见表3），表明水温和氨氮协同作用于孵化过程。当温度和氨氮超过其最佳范围时，温度对西伯利亚胚胎孵化的负效应会增强，死亡率会增加。因此在鲟的实际繁育过程中温度和氨氮的交互作用是需要重点关注的影响因素。值得注意的是，pH和溶解氧会显著影响氨氮和亚硝氮对胚胎发育的影响（Chen et al，2013），即水生生物胚胎对氨氮和亚硝氮的耐受性与水质差异有关。例如，当溶解氧较低时，氨氮对水生生物胚胎的毒性更大（Wang et al，2015; El-Greisy et al，2016）。本文没有考虑pH、溶解氧和盐度等其他因素的影响，也未对西伯利亚鲟受精及仔鱼个体发育阶段进行试验和观察，因此，后续需进一步研究更多环境因素对鲟受精、孵化及幼鱼生长和存活的综合影响。

4   结论

本文采用响应曲面法建立了温度、氨氮和亚硝氮对西伯利亚鲟孵化率的定量关系，并得出西伯利亚鲟胚胎的最佳孵化组合：温度18℃，氨氮浓度低于0.08 mg/L，亚硝氮浓度低于0.13 mg/L。水温与氨氮的联合效应对西伯利亚鲟胚胎孵化率的影响较大，水温与亚硝氮以及氨氮与亚硝氮的联合效应影响不显著。西伯利亚鲟胚胎对温度、氨氮和亚硝氮的耐受范围较窄，未来的环境变化对该物种的影响需要予以更多的关注。

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（责任编辑   张俊友   熊美华）

Combined Effects of Temperature， Ammonia Nitrogen and Nitrite Nitrogen

on Hatchability of Acipenser baerii Embryos

JIA Wen‐fei1，2， YI Yu‐jun1，2

（1. School of Environment， Beijing normal university， Beijing   100875， P.R. China；

2. Ministry of Education Key Laboratory of Water and Sediment Science， School of Environment，

Beijing Normal University， Beijing   100875， P.R. China）

Abstract：Sturgeons are an aquatic organism with important ecological and economic value， but their natural reproduction is threatened by climate warming and human activities. Thus， it is important for sturgeon conservation to explore the effect of environmental factors on embryo development. In this study， we analyzed the combined effects of temperatures （14-22 °C）， ammonia nitrogen （0.05-0.15 mg/L） and nitrite nitrogen （0.05-0.25 mg/L） on the hatching rate of Acipenser baerii embryos. By establishing a quantitative model of temperature， ammonia and nitrite on embryo hatching， we determined the optimal combination of the three environmental factors for embryonic development of this sturgeon species.  The incubation experiments were set using three treatment levels with a three factor Box-Behnken Design and Response Surface Methodology. Results show that the hatching rate of A. baerii embryos increased initially， and then decreased with temperature， and hatching rate increased with decreasing ammonia and nitrite. The combined effect of temperature and ammonia nitrogen on the hatching rate of A. baerii embryos was significant  （p<0.05）， while the combined effects of temperature and nitrite， and ammonia and nitrite were not significant （p<0.05）. The correlation coefficient of the hatching rate of A. baerii embryos toward temperature， ammonia and nitrite was 0.9832， and the adjusted correlation coefficient was 0.9616. The optimal combination of environmental factors for A. baerii embryo development was at temperature of 18 °C， ammonia below 0.08 mg/L and the nitrite below 0.13 mg/L， when the hatching rate of A. baerii embryos peaked at near 90%. Our study will provide theoretical evidence for artificial breeding and conservation of A. baerii.

Key words： Acipenser baerii embryo; temperature; ammonia nitrogen; nitrite nitrogen; hatching rate

收稿日期：2021-11-23      修回日期：2023-05-19

基金项目：国家杰出青年科学基金项目（52025092）；北京市杰出青年基金项目（JQ19034）。

作者简介：贾文飞，1990年生，男，博士研究生，主要从事鱼类生境模拟、泥沙输移等相关研究。E-mail：jiawenfei_512@163.com

通信作者：易雨君。E-mail：yiyujun@bnu.edu.cn