水环境中抗生素的分析检测技术研究进展

王锦 刘珂 梁柳玲 田艳 黄宁

关键词：水环境；新污染物；抗生素；分析检测技术；综述

前言

2022年国务院印发了《新污染物治理行动方案》，方案中将规范抗生素药物的使用作为工作目标之一，并将抗生素纳入了《重点管控新污染物清单》，列为四大典型新污染物之一。抗生素在人类预防细菌和治疗感染性疾病方面发挥了重大作用，但是，由于抗生素的大量频繁使用，近年来，地表水、地下水、饮用水、污水等多种水环境介质中都能检测出不同浓度的抗生素。有文献[1]报道在南明河地表水中共检出34种抗生素，平均含量为257ng/L．其中大环内酯类抗生素检出浓度最高。Fang-ZhouGao等分析检测了养猪村庄井水中的18种抗生素，发现主要污染物是磺胺类抗生素，某一养猪场所用的井水总抗生素浓度超过1200ng/L。崔敬鑫等对菜田水沟、池塘和水井等水样中的15种抗生素进行检测，发现5类抗生素被不同程度检出，浓度范围为0.1～106.2ng/L。这些研究结果表明中国水环境抗生素污染问题已凸显，污染形势严峻，其环境风险与生态毒理效应不可忽视。

目前，国内外抗生素的监测技术主要有酶联免疫法、毛细管电泳法、液相色谱一荧光法、液相色谱一紫外法和液相色谱一串联质谱法等。其中酶联免疫法和毛细管电泳法不适合痕量级别抗生素的检测，紫外和荧光检测器只能选择性检测某些物质。文章综述了水环境中抗生素的分析检测技术，重点综述了近年来水体中抗生素的前处理方法和仪器分析检测技术

1水环境中抗生素的危害、来源以及污染途径

抗生素的滥用使其源源不断地排人环境中，而大多数抗生素的极性较强，具有亲水性和挥发性弱等特性，可以较为方便的借助各种环境介质在土壤、水体和沉积物之中扩散，从而造成了畜类食品、禽类食品、水产品、水体和土壤的污染。此外，抗生素在生物体内可促进细菌耐药性的产生、传播及耐药菌群的形成，进而对水环境的生态安全及人体健康构成威胁。

水环境中的抗生素主要来源于生活污水、畜牧业和水产养殖业的废水、制药企业的工业废水和医院的医疗废水等。抗生素生产过程中的工业废水经过污水处理能去除一部分抗生素，未能去除的抗生素则排入水环境中。进人人体内的抗生素，部分被吸收代谢，未被吸收的抗生素排出体外后通过生活污水或医院医疗废水进入水环境中。在畜牧业和水产养殖业养殖过程中，含有抗生素的动物的尿液和粪便或进入污水中，或常常被用作有机肥料，抗生素通过渗透作用和雨水溢流进入地表水和地下水，或残留在土壤中。特别是水产养殖，抗生素被直接喷洒在养殖水体中，极可能残留在附近水环境中或吸附在底泥中。

2水环境样品中抗生素的预处理和萃取过程

水环境中抗生素的含量相对较低，水溶性比较大，且基质十分复杂，干扰物多，为分离与富集技术提出更高的要求，对于水环境样品中抗生素的预处理方法主要有分散液液微萃取法、冻干法、固相萃取法等，其中固相萃取法运用最普遍。

2.1分散液液微萃取法

分散液液微萃取相当于微型化的液液萃取，因其萃取操作简便、时间短、富集倍数高、溶剂用量少，适用水样中残留污染物的提取。陈文胜等以乙腈为分散剂，正戊醇一甲基叔丁醚为萃取剂萃取水样中的抗生素，萃取时间短，仅用了4min，回收率可达到66.4%～94.0%。但是，方法使用了毒性较大的二氯甲烷和醚类等试剂，对生态环境和人体健康形成危害。由此可见分散液液微萃取也有其局限性，如分散剂和萃取剂种类单一且毒性较大等。

2.2冻干法

冻干法是在低温和真空条件下，通过升华的方式除去样品中的水分，抗生素的结构不易发生改变，极易重新溶解，保证了样品中分析物的活性。Feng-Yang Hu等采用冻干法对环境水样中6种常用抗生素进行富集，在1L水样加入1g柠檬酸，在一80℃条件下放置至少3小时，将50mL水样凝结，再将样品转移到冷冻干燥器，在-86℃和0.1mbar的真空状态下冻干，用1mL10%甲醇一水溶液（0.1%甲酸）超声复溶，该方法对低、中、高三个浓度水平的抗生素回收率均大于70%，检出限可达到ng/L。但是，冷冻干燥法所需时间太长，与当前检测要求时效性高的形势不相符。

2.3固相萃取法

固相萃取法可通过吸附剂和洗脱液选择性地保留与洗脱目标物，从而实现从复杂样品中富集、分离和纯化目标物的目的。如表1所示近几年富集水样中不同种类抗生素和多种类抗生素残留的固相萃取方法。因为复杂样品含有较多的多价态金属离子，这些离子与大环内酯类、喹诺酮类和四环素类抗生素形成螯合物从而降低回收率，大多数研究在水样富集之前加入Na2EDTA以螯合金属并释放出抗生素。水样pH会严重影响化合物的结构、稳定性以及化合物与固相萃取填料之间的作用力，需用酸或碱调节pH使抗生素以分子的形式存在，更好地保留在亲水亲酯柱（HLB）上以提高富集效率。

青霉素类抗生素的结构中大多包含β-内酰胺环，在环境中很容易水解。由于β一内酰胺环对pH值、温度和β-内酰胺酶很敏感，因此要求对抗生素残留的检测方法必须灵敏、快速、高效。李欣等采集水样后在24小时内采用HLB柱富集净化样品中的青霉素，利用液相色谱串联质谱法进行分析检测，回收率为76.4%。

大环内酯类抗生素包含了一个碱性二甲胺基，属于弱碱性化合物。水样pH对某些大环内酯类抗生素影响比较大，有研究发现，当水样pH在3～7之间时，大环内酯类抗生素可被保留在反相萃取填料中，但是，红霉素在酸性条件下会加速降解，转化为脱水红霉素；在酸性和碱性条件下，泰乐霉素不稳定，在中性环境中相对稳定。因此，将水样调到6～7，可提高红霉素和泰乐霉素的回收率，侯锦莹等将地表水水样酸度调为中性，通过HLB小柱富集5种大环内酯类抗生素，回收率在85.4%～96.6%之间。

喹诺酮类抗生素是目前国内外研究比较多的一类抗生素，其分子结构包含羧基，第二代喹诺酮类抗生素在杂环上还有一个氨基。喹诺酮类抗生素根据其酸碱性质被分为两类：酸性和有杂环的喹诺酮，含有杂环的喹诺酮类抗生素属于两性化合物。成晓叶等比较了HLB柱、C18柱和硅胶柱富集水中18种喹诺酮类抗生素，结果发现，在水样pH=10时，采用HLB柱喹诺酮具有较好的回收率，其他许多研究也考察了萃取柱对喹诺酮类的富集效果，结果是使用HLB柱时喹诺酮类抗生素的平均回收率最高。

磺胺类抗生素分子结构包含一个碱性氨基基团和一个酸性磺胺基基团，属于两性化合物，水样pH对磺胺类抗生素的富集净化具有重要影响，多数研究将水样品pH调至酸性后用HLB富集磺胺类抗生素。四环素类抗生素含有并四苯基本结构，在酸、碱中不稳定．此外，含有活性基团，如羰基、烯醇羟基和羟基，在中性条件下易与金属离子形成螯合物。四环素类抗生素与硅醇基有很强的相互作用力难以洗脱，但HLB柱不含有硅醇基，因此较适合四环素类抗生素。

近年来水环境中抗生素的研究日渐趋向于多种类抗生素残留同时分析检测，可实现水环境中抗生素污染水平的快速筛查。HLB小柱具有亲水亲酯性，在酸性、碱性和中性条件下均适用，成为多种类抗生素残留分析首选萃取柱，其次，抗生素酸碱性差异大，水样的pH优化尤为重要。崔敬鑫等将水样pH调至4，采用固相萃取技术富集环境水样中5大类15种抗生素，分析种类多，分析时间快，效率高。封梦娟等将1L表层水体pH调至3，采用HLB柱富集磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和青霉素类等40种抗生素，平均加标回收率为41.3%～112.6%，共检出13种抗生素。

综上所述，传统的液液萃取法虽然无需复杂前处理设备，成本低，但是容易出现乳化现象，增加萃取难度，此外手工操作繁琐，难以实现自动化，且需使用大量的毒性大的有机溶剂，损害人体健康，污染环境，不利于生态环境保护和生态文明建设。与液液萃取相比，分散液液微萃取具有溶剂使用量低、富集倍数高、易实现自动化等优势，但因萃取溶剂单一，而抗生素种类多样，性质各异，使其不适用复杂环境中多种类抗生素的萃取。冻干法因处理日寸间过长，已逐渐被淘汰。在样品前处理技术中，固相萃取法集分离、富集、净化于一体，具有较高的选择性和重现性，被广泛应用于水样中抗生素富集净化。现在市场上已有全自动固相萃取仪和免活化的固相萃取柱，可有效减少溶剂耗费和避免萃取柱堵塞，从水样萃取到浓缩过程自动化程度更高，省时又省力，如此，固相萃取法的应用更加广泛。此外，在线固相萃取技术成为近些年研究的热点，因其具有固相萃取柱重复使用、可实现全自动的前处理和减少系统误差等优点，可进一步加速多残留污染物的快速筛查，特别适用于突发应急事故检测。

3抗生素的分析检测技术

抗生素种类繁多，且环境介质中抗生素的残留量为痕量水平，对抗生素残留的检测技术水平要求较高，目前国内也推出了几个地方标准和团体标准，这几个标准均采用液相色谱串联质谱法测定抗生素。现有的抗生素残留分析方法主要有酶联免疫分析法、高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用法。其中酶联免疫法不适合痕量级别抗生素的检测。液相色谱对大分子量、溶解性有机化合物具备高分离能力，常配备紫外检测器、荧光检测器或将质谱做检测器，但是紫外和荧光检测器只能选择性检测某些物质。如表2所示近几年采用液相色谱一串联质谱法分析不同水质中抗生素的检出限、回收率及样品浓度。

3.1液相色谱一紫外检测法（LC-UV）

LC-UV具有分析速度快、线性范围宽的特点，常用于分析极性强、挥发性低、稳定性差的化合物。但是液相色谱一紫外检测法只依据保留时间定性，抗干扰能力弱，有可能会出现假阳性，且灵敏度低。对于某些没有特征紫外吸收的抗生素难以实现高灵敏度的分析，特别是大部分大环内酯类抗生素，如罗红霉素、阿奇霉素、竹桃霉素等，因缺少发色功能团，没有紫外吸收。不同化合物结构中含有不同的基团，其紫外吸收最大波长不尽相同，常用LC-UV法选择在260～290nm之间作为最大吸收波长测定磺胺类、四环素类和喹诺酮类抗生素，如喹诺酮类抗生素采用紫外波长为248nm或274nm，磺胺类抗生素的检测波长为270nm，检出限可达ng/L。

3.2液相色谱一荧光法（LC-FLD）

大多数喹诺酮类抗生素自身有较强荧光吸收，而荧光检测器仅对有荧光吸收的化合物有响应，且选择性好，灵敏度高。喹诺酮类抗生素的激发波长和发射波长分别为276～297nm和444～506nm，检出限可达几个ng/L。磺胺类和大环内酯类等抗生素本身没有荧光吸收，对于这些不发荧光的化合物其测定过程中需要进行衍生，而大环内酯类抗生素在荧光衍生化过程易导致分解，如红霉素。步骤繁琐且重现性较差等缺陷限制了荧光检测器的应用。

3.3液相色谱一串联质谱法（HPLC-MS/MS）

HPLC-MS/MS是以高效液相色谱为分离手段，质谱为检测器的一种重要的用于分离和鉴定的检测技术，不仅具有柱效高、分析速度快和化学基质干扰小等特点，而且检测灵敏度高、特异性强，以满足样品中痕量物质的分析，还可以给出化合物的分子量以及丰富碎片信息，以便进一步确证化合物结构，极大的提高了定性定量分析能力，避免生物法在特异性和准确性方面的欠缺，也可弥补液相色谱法定性困难抗干扰能力弱的不足，成为复杂样品中物质分离分析研究的不可缺少有效手段，是同时检测多残留抗生素的理想工具。

HPLC-MS/MS分析多残留抗生素，基质干扰小，可用于检测不同基质的水样，检出限可达ng/L，甚至pg/L。王娅南等采用SPE-HPLC-MS/MS分析地表水中15种磺胺类、9种氟喹诺酮类、7种大环内酯类、3种四环素类、2种氯霉素类和4种其他类共40种抗生素，方法检出限为0.002～0.270ng/L，加标回收率为61.0%～149%。也有研究采用SPE-HPLC-MS/MS．测定地下水和地表水中磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类和氯霉素类15种抗生素，保留时间在5.5min内，分析时间短，检出限为2.1～22.0ng/L，回收率为50.1%～109%。王锦[10]等建立了分析检测水库、地表水、污水处理厂出口、畜禽养殖场等不同类型水样中喹诺酮类、大环内酯类和青霉素类抗生的SPE-HPLC-MS/MS法，方法检出限为2.3～10.7ng/L，回收率为61.2%～129%。

综上所述，液相色谱法是分析水样中抗生素较为普遍的方法，对抗生素的检测均有较好的选择性和精密度。但液相色谱一紫外检测法和液相色谱一荧光法具有局限性，只能检测有特征紫外吸收或发荧光的抗生素，且灵敏度不够，抗干扰能力差，容易出现假阳性，在当前复杂的环境污染情况下，不适用于同时分析基质复杂水样中多种类抗生素。而液相色谱一串联质谱法正好克服了液相色谱一紫外检测法和液相色谱一荧光法的缺点，利用液相色谱高效分离和串联质谱准确定量的能力可实现抗生素高质量的检测，成为当前同时检测复杂样品中多残留抗生素的理想分析方法。

4结束语

文章综述了国内外近年研究水环境中抗生素的检测技术，结合各类抗生素的化学性质对前处理技术和液相色谱检测技术的优缺点进行了重点阐述，并对方法中可能影响萃取效率和分析检测的各种因素进行了分析总结。国内外相关研究已经很多，国内地方标准中抗生素组分少，类别少，不足以检测多残留抗生素。由于抗生素种类多样化，性质各异，建立环境介质中最佳的多残留抗生素分析检测标准方法以监控和了解环境中抗生素的浓度水平将会是一项重大挑战，建立健全统一的国家标准体系以摸清抗生素环境赋存底数，进一步控制和管控抗生素对环境的污染以及研究抗生素治理技术已迫在眉睫。在线筛查和监测环境水体中的抗生素转移和代谢物将是今后发展的方向。