十一种植物中原花青素单体和低聚体的比较分析

李倩 邓艳红 赵聪 赵鹤 张春晨 蔡慧珍 杨晓辉

摘 要：对十一种植物花瓣、籽、果实或果皮中的原花青素主要单体和低聚体进行检测，分析比较不同植物中原花青素组成和含量的差异.十一种植物样品分别经85%乙醇超声提取、Oasis PRiME HLB固相萃取凈化后，采用高效液相色谱法（HPLC）分离分析其中的儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2.结果表明，在所选色谱条件下，十一种植物中都能检出原花青素单体或低聚体，且含量以原花青素低聚体为主.其中葡萄籽中原花青素含量最高、种类最多，六种原花青素单体和低聚体均有检出；其次是玫瑰花瓣、花生红衣，分别检出儿茶素和没食子酸两种原花青素单体和原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2三种低聚体；蓝莓、核桃仁、黑枸杞和紫甘蓝除检出一种原花青素单体外，蓝莓和核桃仁中三种原花青素低聚体均有检出，而黑枸杞和紫甘蓝只检出了原花青素B2和原花青素B4两种低聚体；红皮土豆皮和紫薯皮中仅检测到了原花青素低聚体；火龙果皮和红辣椒中原花青素单体和低聚体种类少，含量低.此外，葡萄籽和皮、花生红衣和花生仁为同一植物的不同部位，其原花青素种类和含量差别很大.不同植物中原花青素的种类和含量不同；同种植物不同部位的原花青素种类和含量也不同.原花青素在不同植物中分布情况、组成差别和含量上的差异，为植物原花青素的构效关系研究及其开发利用奠定了基础.

关键词：植物；原花青素；单体；低聚体；比较分析；高效液相色谱

中图分类号：TS201.2

文献标志码： A

文章编号：2096-398X（2023）04-0058-06

Abstract：The major monomer and oligomer of proanthocyanidins from the petals，seeds，fruits or pericarps of 11 plants were detected，and the difference of proanthocyanidin contents were analyzed in a variety of plants in this study.The catechin （C），epicatechin （EC），gallic acid （GA），procyanidin B2 （PCB2），procyanidin B4 （PCB4），procyanidin A2 （PCA2） of the 11 plants were extracted by 85% ethanol solution under ultrasonic，purified by Oasis PRiME HLB solid phase extraction column and separated by high performance liquid chromatography （HPLC）.The result showed that monomers or oligomers of proanthocyanidins could be detected in 11 plants under the selected chromatographic conditions，and the content was mainly proanthocyanidin oligomers （OPC）.Among them，the content of proanthocyanidins in grape seeds was the highest and the types were the most.Six proanthocyanidin monomers and oligomers were all detected in grape seeds.Two monomers，C and GA，and three oligomers，PCB2，PCB4 and PCA2，were detected in rose petals and peanut seed coats，respectively.In blueberry，walnut kernel，lycium ruthenicum murray and purple cabbage，except one proanthocyanidin monomer was detected，three kinds of proanthocyanidin oligomers were detected in blueberry and walnut kernel，while only PCB2 and PCB4 were detected in lycium ruthenicum murray and purple cabbage.The pericarp of red potato and purple potato only had OPCs; and the types of proanthocyanidin monomers and oligomers in red pepper and pericarps of dragon fruit were few and the content was low.In addition，the seed and pericarp of grape，peanut kernel and its seed coat were different parts of the same plant，and the types and content of proanthocyanidins were different.The types and contents of proanthocyanidins in different plants were different.The types and contents of proanthocyanidins in different parts of the same plant were also different.The differences of distribution，composition and concentration of proanthocyanidins in different plants lay a foundation for the study of structure-activity relationship and its development and utilization.

Key words：plants; proanthocyanidins; monomer; oligomer; comparison and analysis; high performance liquid chromatography （HPLC）

0 引言

原花青素（proanthocyanidins，PC）是植物中广泛存在的多酚类物质之一［1］，是由不同数量的儿茶素（catechin，C）、表儿茶素 （epicatechin，EC）单体聚合而成的低聚体和高聚体组成的混合物［2，3］.其中，由2-4个单体聚合而成的叫做低聚原花青素（oligomeric proanthocyanidins，OPCs），由5个以上单体聚合而成的叫高聚原花青素（polymeric proanthocyanidins，PPCs），高聚原花青素的聚合度可以高达数十，甚至数以上百 ［4，5］.据报道，PC具有多种生物学特性，包括抗氧化［6］、抗癌［7］、抗动脉粥样硬化［8］、降血压［9］、降血糖［10］、降血脂［11］、抗肥胖和美白等作用［12-15］，尤其是其抗氧化活性极强，在人体内清除自由基的能力是维生素E的50倍 ，维生素C的20倍 ，还具有保护血管 、抗肿瘤作用［16］.这些生物学特性，使得PC在医学、营养学和化妆品领域得到广泛应用［17，18］.PC主要存在于植物的皮、壳、籽、核、花、叶中［19，20］，其中葡萄籽和果皮、花生红衣、黑果枸杞目前研究较为广泛［21，22］.国内外研究者对原花青素的生理活性和化学结构进行了探索，发现植物原花青素的抗氧化活性与单体组成、单体之间的连接方式及聚合程度等均有关［23-25］.植物中原花青素的生理活性对于预防各种疾病具有明显的优势，但因植物原花青素的种类繁多、结构复杂，不同材料、提取方式和制备条件不同，甚至是同一种植物的不同部位，获得的原花青素组成和含量都有所差异，也使得不同植物原花青素生理活性不同.植物原花青素的组成和结构的多样性以及植物个体之间的差异性为其构效关系的研究带来了极大的困难.

近年来，国内外学者对于植物中原花青素的提取及生理功效研究颇多，但大多集中于对单一植物原花青素的研究中，对于不同植物中原花青素的组成和含量的比较研究甚少.本文采用超声提取、Oasis PRiME HLB固相萃取净化，高效液相色谱法（HPLC）对葡萄、玫瑰花、花生、蓝莓、黑枸杞、核桃仁、紫甘蓝、紫薯、红皮土豆、火龙果、红辣椒11种植物花瓣、籽、果实或果皮中的主要单体和低聚体进行分离分析，比较原花青素在不同植物中分布情况、组成和含量的差异，为植物原花青素的构效关系研究及其开发利用提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄、玫瑰花、花生、蓝莓、黑枸杞、核桃仁、紫甘蓝、紫薯、红皮土豆、红心火龙果、红辣椒均购买自宁夏银川市新百大卖场；儿茶素标准品（纯度≥98%）、表儿茶素标准品（纯度≥98%）、没食子酸标准品（纯度≥98%）、原花青素B2标准品（纯度≥98%）、原花青素B4标准品（纯度≥98%）、原花青素A2标准品（纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯），赛默飞世尔科技有限公司；乙醇（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；冰乙酸（色谱纯），天津市大茂化学试剂厂；水为自制超纯水.

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（L-2000），日本日立公司；有机系进口NY滤膜（0.22 μm），Fount Beijing Biotech Co，LTD；Oasis PRiME HLB （3 cc，150 mg，2 mL，部件号186008717，使用前无需活化），沃特世科技（上海）有限公司；超声波清洗器（KQ3200DA），昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE-52AA），上海亚荣生化仪器厂；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ），郑州长城工贸有限公司；台式高速离心机（TDL-5-A），上海安亭科学仪器厂；移液枪（H47039F），德国艾本德.

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent 5 TC-C18（250×4.6 mm）；柱温：27 ℃；流速：0.6 mL/min；进样量：5.0 μL；波长：280 nm.流动相A：甲醇；流动相B：1.0%冰乙酸溶液.梯度程序洗脱：0～10 min，10%A；10 ～15 min，50%A；15 ～25 min，100%A；25～30 min，10%A.

1.3.2 标准溶液的配制

分别精密称取儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2标准品各2.5 mg，用甲醇溶解定容至25 mL的棕色容量瓶中，配制成质量浓度为100 mg/L的混合标准储备液.用甲醇逐级稀释混合标准储备液，得到1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L和100 mg/L的混合标准系列溶液，搖匀，于4 ℃冰箱保存备用.

1.3.3 样品前处理

将葡萄（葡萄籽和葡萄皮）、玫瑰花瓣、花生（花生红衣和花生仁）、蓝莓、黑枸杞、核桃仁、紫甘蓝、紫薯皮、红皮土豆皮、火龙果皮、红辣椒清洗干净烘干，分别研磨粉碎后各精密称取2.5 g于50 mL具塞三角瓶中，分别加入25 mL 85%乙醇溶液，30 ℃下超声辅助提取 30 min，提取液以3 000 r/min离心5 min后，将上清液转移至圆底烧瓶中，残渣重复上述操作，合并2次上清液，在旋转蒸发仪中蒸至近干，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，取此溶液2 mL经Oasis PRiME HLB 固相萃取柱净化［26］后，0.22 μm有机系微孔滤膜过滤，于4 ℃冰箱保存待测.

1.3.4 方法学考察

为了检验实验样品分析方法的准确性和可靠性，实验同时做重复性实验、精密度实验、样品加标回收率实验和稳定性实验，计算加标回收率和相对标准偏差，并考察了定量限和检测限.

（1）重复性实验

取葡萄籽和果皮、玫瑰花瓣、花生红衣和果仁、蓝莓、黑枸杞、核桃仁、紫甘蓝、紫薯皮、红皮土豆皮、火龙果皮、红辣椒，每种原料各三份，每份各2.5 g，按照1.3.3方法进行处理，获得的样品溶液分别在1.3.1的色谱条件进行测定，计算各待测样品中儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的相对标准偏差.

（2） 精密度实验

取20 mg/L混合标准溶液经0.22 μm有机系微孔滤膜过滤后，按照1.3.1的色谱条件，在HPLC上连续进样三次，分别通过儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的峰面积，计算出RSD值.

（3） 加标回收率实验

准确称取各植物待测花瓣、籽、果实或果皮样品2.5 g，每种平行取三份，分别加入质量浓度为20 mg/L的混合标准溶液0.5 mL、1 mL、1.5 mL，并按照1.3.3方法进行样品提取和净化，经0.22 μm有机系微孔滤膜过滤后，按照1.3.1的色谱条件依次进样分析，依据其峰面积计算各样品的加标回收率.

（4）稳定性试验

取20 mg/L混合标准溶液，分别于0 h、5 h、10 h、15 h、20 h、24 h按1.3.1项下试验条件进行测定，记录峰面积，计算日内相对标准偏差.

（5）定量限和检测限

取1.3.2项下混合标准系列溶液按1.3.1项下试验条件进样测定，记录儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的信噪比（S / N），以S/N为3∶1时的质量浓度为检测限，以S / N为10∶1时的质量浓度为定量限.

1.4 数据处理

数据采用EXCEL 2021进行录入计算，Origin8.6对儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2标准系列进行线性回归和色谱图的绘制.

2 结果与讨论

2.1 色谱分离条件的选择

将1.3.2所配制的儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2混合标准溶液在1.3.1所列的色谱条件下采用HPLC进行分离分析，其色谱图如图1所示.

由图1可知，儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2在此实验条件下都能够得到较好的分离，经同条件下单标定性分析，确定其归属，按照出峰顺序依次为没食子酸、原花青素B4、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素和原花青素A2.采用此色谱条件测定各植物原花青素中儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的含量，分离效果良好，结果较为满意.

2.2 植物原花青素单体和低聚体含量比较

实验采用乙醇作为提取溶剂，经超声辅助提取十一种植物花瓣、籽、果实或果皮中的原花青素，Oasis PRiME HLB 固相萃取柱净化后采用HPLC在上述色谱条件下分离分析，分别得到不同植物中总儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的含量，并以重复性实验计算相对标准偏差，结果如表1所示.

由表1可知，在实验所用提取、分离条件下，十一种植物中都能检出原花青素单体或低聚体，含量以原花青素低聚体为主.其中葡萄籽、玫瑰花瓣、花生红衣、核桃仁中三种原花青素低聚体含量高达2 225～7 236 mg/kg.

实验结果显示，相同的提取、分离、检测条件下，不同植物中原花青素的种类和含量不同.由表1可以看出，葡萄籽中六种原花青素单体和低聚体均可检出，且总含量最高；玫瑰花瓣和花生红衣中原花青素种类和含量次之，除表儿茶素以外，均可检出儿茶素和没食子酸两种原花青素单体和原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2三种低聚体，且低聚体含量远高于单体含量；蓝莓、核桃仁、黑枸杞和紫甘蓝中原花青素单体种类少，仅检出儿茶素或没食子酸一种单体，且含量低，蓝莓和核桃仁中检出三种原花青素低聚体，黑枸杞和紫甘蓝中检出了两种低聚体，其中蓝莓、核桃仁和紫甘蓝中原花青素B2含量最高，而黑枸杞中原花青素B4含量最高；红皮土豆皮和紫薯皮中未能检出原花青素单体，仅检测到了原花青素低聚体，且红皮土豆的含量和種类都多于紫薯皮；火龙果皮和红辣椒中原花青素种类少，含量较低.

实验还对比了同一提取、分离、检测条件下同一植物不同部位的原花青素，其种类和含量差别也很大.从表1可以看出，葡萄籽中三种原花青素单体和三种原花青素低聚体均可检出，且含量均高，而同条件下葡萄皮中仅检测到了两种单体和两种低聚体，且含量均远远低于葡萄籽；花生红衣和花生仁相比，原花青素单体的种类和含量差异明显，花生红衣中原花青素低聚体种类和含量远远多于花生仁.

植物原花青素属于天然抗氧化剂，广泛存在于自然界中，由不同的的单体连接而成聚合体.国内外学者对原花青素的生理活性和化学结构关系的研究发现，原花青素单体组成和聚合程度、结构和含量都是是影响生理活性的重要因素［23-25］.植物原花青素的种类繁多、结构复杂，表1所示的实验结果表明，不同植物，甚至是同一种植物的不同部位，获得的原花青素组成和含量都有所差异，这为不同植物原花青素生理活性的差异提供了支撑，也为其构效关系的研究提供了有力的依据.

2.3 方法学考察结果

将1.3.2所配混合标准系列溶液在1.3.1所列液相色谱条件下进样分析，以峰面积为纵坐标，混合标准系列溶液的质量浓度为横坐标进行线性回归，同时做样品加标回收率、精密度实验和稳定性实验.儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的线性回归方程、相关系数、线性范围、平均加标回收率（添加水平为4 mg/kg、8 mg/kg、12 mg/kg）、相对标准偏差（RSD）和检测限、定量限如表2所示.由表2可知，儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2在1.0～100.0 mg/L浓度范围内具有较良好的线性关系，相关系数均大于0.99，平均加标回收率在91%～106%，符合分析方法的要求；相对标准偏差为1.52%～3.96%，方法的精密度良好；稳定性实验表明混合标准溶液在常温下24 h内稳定性良好.

3 结论

植物原花青素的种类繁多、结构复杂，不同植物中原花青素的种类和含量不同，同种植物间不同部位的原花青素种类和含量差异较大，这也是导致不同植物原花青素生理活性不同的主要原因.实验分离分析了十一种植物中原花青素的三种单体和三种低聚体，比较其在不同植物和同种植物不同部位中分布情況、组成和含量的差异，为进一步研究植物原花青素的构效关系及其药物的研制和开发利用提供了有利的依据.

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【责任编辑：陈 佳】

基金项目：宁夏自然科学基金项目（2021AAC03141）；宁夏医科大学大学生创新创业训练计划项目（X202210752003）

作者简介：李 倩（1997—），女，山西吕梁人，在读硕士研究生，研究方向：营养与食品卫生学

通讯作者：杨晓辉（1979—），女，宁夏中宁人，副教授，研究方向：分析化学及食品分析检验，20060008@nxmu.edu.cn