功能性引导骨再生屏障膜的组织工程设计

王 焱

(中山大学附属口腔医院，光华口腔医学院，广东省口腔医学重点实验室，广东省牙颌系统修复重建技术与材料工程技术研究中心，广州 510055)

引导骨再生（guided bone regeneration，GBR）术是一种被广泛应用于口腔种植和牙周临床的技术，其通过屏障膜的使用，在牙龈软组织与骨缺损之间建立生物屏障，阻挡上皮和成纤维细胞长入骨缺损区，为成骨细胞增殖、新骨形成提供一个相对封闭的环境，从而达到引导骨组织再生和定向修复的目的[1]。理想的引导骨再生屏障膜应具有良好的机械性能，包括良好的空间维持性能和临床可操作性，良好的生物性能如生物相容性、生物活性、组织选择性和抗菌性等，以适配复杂的口腔组织环境并促进新骨形成[1]。

在各类GBR 膜材料中，天然高分子材料来源的屏障膜，如胶原、明胶、壳聚糖、丝素蛋白等，生物相容性相对较好，但通常机械强度低、降解速度快，难以支撑大面积骨缺损的再生空间[2]，且功能较为单一。因此，人工合成功能性GBR 屏障膜材料的研发对于临床具有重要意义。目前，人工合成可吸收聚合物膜的细胞亲和性和骨传导活性仍较弱[3]，且其降解过程可能释放酸性副产物引起炎症反应[4]，影响临床效果。近年来，广大学者从口腔软硬组织固有的再生环境和再生过程出发，基于骨组织工程的策略，将骨再生相关分子、成骨活性细胞与支架材料三者复合，并结合先进的纳米工程技术，调控材料的功能成分和理化结构，从而获得可以适配组织再生过程各种活性分子、活性细胞、组织生长需求的新型功能屏障膜，以获得更理想的临床疗效，满足临床更高的需求。本文就近年基于组织工程理论对GBR 功能屏障膜材料进行改性的技术及方法进行总结梳理，以期为广大临床及科研工作者提供参考。

1 功能成分调控

屏障膜在GBR 过程中不仅仅起到被动物理屏障作用，更能发挥主动的生物活性功能促进骨组织再生。基于骨组织工程原理，通过改变屏障膜支架的成分和结构，可调控成骨细胞的黏附、增殖、分化，促进新生骨的沉积。其中，屏障膜功能成分的调控策略主要包括添加骨再生相关生长因子、生物活性骨替代材料、促成骨活性药物或化学成分、骨免疫调控的金属活性离子、抗菌成分等。

1.1 添加骨再生相关生长因子

如何调控多种具有不同生物活性的生长因子在骨再生的相应阶段发挥作用，模拟自然成骨过程，是近代骨组织工程的主要研究热点。屏障膜可以作为成骨相关生长因子的良好缓释载体，形成生物活化功能性膜，促进成骨活性细胞的增殖和表达。目前常用的促骨组织生长因子主要有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、血小板源生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor, IGF)和转化生长因子β（transforming growth factor, TGF-β）等[5]。BMP是骨组织工程中应用和研究最广泛的生长因子之一，具有促进间充质干细胞定向分化增殖为成骨细胞的能力。它可以与各种具有不同性质的GBR 载体膜结合，赋予膜促进骨再生的生物活性[6]。目前在屏障膜材料中添加生长因子的主要技术难点在于生长因子的活性保持、有效/安全浓度的控制和释放控制。另外，生长因子的成本也是产品临床转化中需考虑的另一因素。

1.2 添加生物活性骨替代材料

将具有骨传导性的骨替代材料如磷酸钙、羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、β-磷酸三钙被加入屏障膜中，能起到促进成骨细胞的增殖和分化、增强新骨矿化沉积、促进骨组织再生的作用。研究报道磷酸钙改性的丝基膜可检测到更显著的新骨形成[7]。还有研究使用电喷雾或超声涂布方法对聚（D，L-乳酸）/聚（D，L-丙交酯-乙交酯）膜表层进行HA 纳米粒子涂布，涂层聚合物膜显示出更好的成骨细胞代谢活性[8]。自20 世纪60 年代后期以来，用于组织工程再生医学的生物活性玻璃被广泛开发和应用。生物活性玻璃具有良好的软硬组织黏附性，以及骨传导、骨诱导和促血管生成特性，被认为是第三代生物医学材料[9]。将其通过表面涂层技术涂覆在生物屏障膜表面，可达到明显的功能改善。Dau 等的研究已显示通过旋转喷涂法制备的二氧化硅增强纳米HA 涂层胶原膜显示出显著提升的促血管化特性[10]。

1.3 添加促成骨活性药物或化学成分

部分促成骨的药物或化学成分可影响局部成骨微环境，从而调控成骨过程。双膦酸盐通过减弱破骨细胞活性来干扰骨转换过程，从而减少骨破坏吸收。Vab Oirschot B 等报道了睾酮和阿伦膦酸盐药物涂层的PLA 胶原膜显示出优于无药物对照组的骨再生效果[11]。还有部分研究报道了化学药物辛伐他汀、化学分子N-甲基吡咯烷酮[12]和GlyT2-IN-1（Yoda1）[13]、生物活性提取物表没食子儿茶素没食子酸酯[14]等化学药物应用于改良屏障膜性能的实验，结果均显示出一定的促骨再生效果。此外，一些其它动植物活性成分如BMP-2 相关肽P28，釉原蛋白和淫羊藿苷也已应用于骨组织工程[15]，表现出可应用于GBR 屏障膜改性的促成骨潜能。总体而言，目前关于药物成分应用于屏障膜的研究较少且较为分散，在其研发过程中，药物成分的生物安全性和细胞毒性需要重点关注，部分药物促组织再生的具体机制还需更进一步探究。

1.4 添加骨免疫调控的金属活性离子

近年来，功能性GBR 屏障膜的研发除了关注干细胞成骨分化的直接调控，还关注对干细胞分化的微环境尤其是免疫微环境的管理，通过创造利于成骨分化的局部微环境，诱导新骨的形成。研究表明，金属活性离子如锌（Zn）、镁（Mg）、钴（Co）和锶（Sr）等具有良好的成骨调控和免疫调控作用[16]。在可吸收胶原膜降过程中，微量金属活性离子的释放可以调节局部的成骨微环境，促进骨再生。锌是一种有效的骨免疫调节剂，影响巨噬细胞极化和成骨细胞分化[17]。有研究报道金属有机框架晶体修饰的电纺不对称双层聚己内酯/胶原（PCL/Col）膜实现了锌离子的pH 响应性释放，在体外和体内均显示骨诱导性和血管生成增强[18]。总体而言，金属活性离子可赋予屏障膜活性功能，不易分解，作用效果较稳定，作为骨免疫调控因子用于骨组织工程研发可吸收功能屏障膜具有良好应用前景。需注意的是，金属离子的作用具有浓度依赖性，其释放速率和浓度调控是优化其在屏障膜中作用的关键环节。

1.5 添加抗菌成分

细菌虽然不直接参与骨组织再生过程，但细菌感染引起的炎症反应会激活破骨细胞，抑制成骨细胞的生长，引发骨吸收。因此，在膜中添加抗菌成分能有效降低术后感染的风险，在一定层度上保障新骨的正常生成。抗菌成分主要通过涂层方式和结构载药缓释系统应用于功能屏障膜。聚乙二醇、超疏水结构涂层、生物膜基质降解酶涂层、银纳米粒子涂层、二氧化钛光活性涂层等物质被广泛用于抗菌屏障膜的制作[15]。静电纺丝作为一种新的纳米支架制备技术，可用于制备载药缓释系统。常用的抗菌药物和化合物如阿司匹林、阿奇霉素、甲硝唑、抗菌肽等可通过静电纺丝技术装载进电纺纳米纤维膜中，且可通过改变加工参数来调控药物的装载效率和释放特性[19]。Boda 等人通过静电纺丝法将一种负载抗菌肽D-GL13K 的氧化果胶的涂覆于壳聚糖膜上，结果显示载有抗菌肽的壳聚糖膜具有优异的抗菌性能[20]。抗生素和其它抗菌活性物的在屏障膜中的附加使用需要关注其耐药性和细胞毒性，如何更好地负载抗菌成分、调控其特异性释放和长时间发挥作用仍是研究热点。

2 理化结构调控

基于组织工程原理，除了功能成分，屏障膜的孔隙结构、表面形貌、降解速度、膜层数结构、仿生矿化等都可在一定程度上调控细胞迁移、黏附等生理活动，最终影响GBR 技术的效果。

2.1 屏障膜的孔隙结构

孔隙结构是GBR 屏障膜的一个重要性质，屏障膜材料的孔隙率和孔隙大小会影响长入细胞的类型，包括牙龈上皮细胞、成纤维细胞、免疫炎症细胞、血管组织及骨组织细胞等。选择合适的孔隙率和孔隙大小，对于促进骨组织的生长起着至关重要的作用。在胶原膜材料中，随着孔隙率和孔隙大小的增加，巨噬细胞M2 相关标志物表达增加，而M1 相关的标志物表达下降[21]。据报道，e-PTFE膜5-30 μm 大小的孔隙容易导致细菌污染和软组织的牢固附着。随后开发的具有亚微米0.2 μm 孔径的高密度(d)-PTFE，可避免此种现象[22]。Gutta 等研究提示钛膜中超过1 mm 的大孔径可以促进更好的骨再生[23]。目前临床及实验室报道的各类屏障膜的孔隙率和孔隙大小各不相同，最佳的膜孔隙率和孔隙大小也尚无定论，需要更加严格地控制实验因素，通过进一步的系统研究去验证。同时，膜的多孔性和渗透性在局部骨缺损区促进骨愈合的具体作用机制也需进一步探究。

2.2 屏障膜的降解速度

对于可吸收屏障膜，其降解速度应该与新骨的形成速度相匹配，以维持局部轮廓。天然胶原膜虽然具有良好的生物相容性，但仍存在降解不规则、降解速率过快、空间稳定性差等问题，通常只能维持30 天左右，容易导致手术部位塌陷[24]。目前可有以下几种方法改进：1）多层膜叠加获得更加致密的结构以及更长的降解时间；2）通过各种方法增加胶原蛋白交联度，从而降低降解速度；3）通过添加其他降解时间更长的生物材料，如生物陶瓷、碳和聚合物材料等；4）采用人工材料如PLA，PLGA，PCL 等，通过静电纺丝等技术制备成纳米纤维支架材料，延长降解时间，同时可获得良好的比表面积、机械强度和仿生效果[25]。另外，更为理想的多功能GBR 膜材料还可充当药物或生物分子的载体，降解速度可适配GBR 过程不同细胞的生长需求以及不同阶段成骨和抗菌需求，因此，膜的成分、结构及降解行为也可根据不同的阶段的组织再生需求去进行材料设计，从而达到理想的材料基因工程的理念。

2.3 多层屏障膜

设计不同功能和结构的多层屏障膜可赋予屏障膜更加丰富的性能，以满足更加复杂的临床要求。每层膜应具有不同的结构特性：内层（疏松层）高孔隙率有利于成骨细胞的粘附和增殖，同时稳定血凝块，促进软组织在双层膜中的整合。外层（致密层）的孔隙率较小且强度大，阻止成纤维细胞向骨缺损区的迁移，允许干细胞和营养物质通过，同时维持成骨空间。此外，双层膜结构之间存在的间隙应能够促进组织整合[26]。有研究利用静电纺丝和光交联技术制备了明胶甲基丙烯酰胺（gelatin methacrylamine，GelMA）/ 聚乙二醇二丙烯酸酯（poly ethylene glycol diacrylate，PEGDA）双层膜。该膜具有纤维纳米结构和水凝胶性质的双层结构，内层具有高孔隙率而外层具有低孔隙率。控制交联时间和PEGDA 比例也可以调节双层膜的物理性质、降解速率、细胞粘附和增殖[26]。功能梯度膜（functionally gradient membrane, FGM) 也是一种特殊的多层屏障膜。其成分或结构呈连续或梯度分布，因此除了结构，其功能也呈梯度变化[27]。多层屏障膜是一种新的发展趋势，可用于克服单一材料的不足。利用不同膜材料或不同制备技术，如3D 打印、空气等离子体、静电纺丝和光交联的组合、紫外线照射或化学溶液浸渍和交联的组合等，可制作不同结构不同特性的多层膜，使其发挥更加全面的作用。但另一方面，复杂的制备工艺和高制作成本一定程度上又限制了其生产和应用。

2.4 仿生矿化

仿生矿化，即模拟天然组织的化学成分和微观结构，通过分子仿生合成、分子自组装等技术，人为调控无机矿物在有机物模板上的沉积，从而制备出具有高度模拟生物矿化组织的显微分级结构和优异力学性能的无机有机复合材料[28]。胶原模板本身具备优异的生物相容性，其所含的矿化钙磷晶体可模拟天然骨组织的无机成分；与此同时，仿生矿化胶原材料本身具备的三维多孔结构又使其具有优良的骨传导性, 为血管和新生骨组织提供了良好的生长空间[29]。

通过仿生矿化的方法对胶原膜材料进行改进, 可获得显著提升的机械强度和骨传导性等性能以适应临床应用的需求。有研究通过偶联高分子量聚丙烯酸可实现胶原类屏障膜的纤维内自矿化，该仿生矿化胶原膜可通过激活线粒体动力学途径促进间充质干细胞的成骨分化，同时基于该仿生矿化策略可提高胶原基质的刚度，为间充质干细胞介导的骨组织再生提供有利的机械力学信号[30]。近期有研究报道了具有免疫调控作用的imRNA- 无定形磷酸钙矿化前体介导的仿生矿化胶原膜，该材料不仅在骨缺损区域完成了快速矿化，还能通过激活JAK2/STAT3信号通路诱导巨噬细胞表型分化促进血管化骨再生进程[31]。

总之，仿生矿化可赋予屏障膜优异的成分和结构特性，利于骨再生。此外，通过在仿生矿化胶原内添加生物活性因子等还可进一步赋予其促进干细胞的黏附、增殖和成骨分化的能力，具有良好的应用前景。

3 电化学调控

骨组织修复和再生的过程需要多种生理信号，包括生物化学信号、机械信号和电信号，它们共同作用以保障组织形态和功能的恢复。天然骨组织本身具有压电效应，它在响应机械活动时产生的电荷/电位能够促进骨的生长。而电活性生物材料能够直接对细胞传输电化学信号以诱导干细胞成骨分化和促进组织再生[32]。电活性生物材料可以分为压电材料和导电材料。其中压电材料由于其响应机械变形而产生电荷/电势的能力，可以在骨缺损区形成仿生电学微环境，具有良好的骨诱导性，在骨组织工程领域显示出巨大的潜力。

用于骨组织工程的压电材料类型主要包括了人工聚合物如聚L-乳酸（poly L-lactide，PLLA）、聚偏氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF) 、聚偏氟乙烯-三氟乙烯（Poly vinylidene fluoride-trifluro ethylene，PVDF-TrFE）、聚羟基丁酸酯等；陶瓷类材料如HA、铌酸锂、钛酸钡、氮化硼纳米管等[32]。近年来，通过使用具有压电活性的屏障膜材料或者在屏障膜中添加电活性材料使其具有压电活性已受到越来越多的关注。目前关于压电材料应用于屏障膜的研究主要集中于人工聚合物材料和陶瓷材料及其复合材料。有研究证实，具备电活性的PLLA 膜具有可吸收性和良好的促成骨能力，化学改性后的PLLA 胺基生物膜可以促进细胞的黏附和增殖，增加体外实验骨缺损区的新骨形成[33]。还有研究表明，含5%钛酸钡纳米颗粒的PVDF-TrFE 膜具有和天然骨组织接近的压电系数，可以诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，能有效地促进血管化成骨[34]。通过调整压电成分在屏障膜中的比例或者压电膜本身的压电系数，可改变膜材料表面及内部的电学微环境，使其有利于新骨形成，从而改善骨缺损局部组织再生的进程，这也成为调控屏障膜性能的一种重要的电化学策略。压电屏障膜材料的未来研究方向是对材料亲水性、压电性能和表面形貌进行改进，并结合药物递送和抗菌性能的提升，以及与干细胞的结合运用。

4 挑战及展望

基于组织工程策略的新型功能性GBR 屏障膜研发，总体理念在于调控材料的功能成分和理化结构，以期获得可以适配组织再生过程的局部再生微环境需求的新型功能屏障膜。随着生物材料、纳米技术、组织工程等的发展，新型GBR 屏障膜的研发内容更加多元化，分支也更加广泛，但目前尚无一种新型膜能完全满足理想GBR 屏障膜的所有要求，关于屏障膜的研发，目前大部分研究也仍处于实验室阶段；同时，一些深入的分析研究也有待进行，如各种因子、成分负载于膜上作用的交互作用、时空效应和潜在机制等，确定合适的改性方法和材料的组合仍应是未来研发屏障膜的主要方向。总之，新型功能性GBR 屏障膜从实验室材料设计、研发到最终临床转化仍有很长的路要走，但是遵循组织工程学的原理去进行材料设计将是未来重要的一种趋势。

衷心感谢王小双博士在本文文献检索及资料整理等方面所做的大量工作。