循环水养殖系统中3 种生物填料的挂膜、微生物群落组成及对大口黑鲈生长的影响

李 倩，孙丽慧，郭建林，郑 刚，姜建湖，陈建明，高令梅

（1.浙江省淡水水产研究所，农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室，湖州市水产品品质提升与加工技术重点实验室，浙江 湖州 313001；2.浙江大学 舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316100）

大口黑鲈（Micropterus salmoides）又名加州鲈，隶 属 于 辐 鳍 鱼 纲（Actinopterygii）、鲈 形 目（Perciformes）、太阳鱼科（Cehtrachidae）、黑鲈属（Micropterus），原产于美国加利福尼亚州[1]，具有生长快、味道鲜美、营养丰富、经济价值高等优点，已成为我国重要的淡水养殖品种之一。近年来，在渔业转型升级和大力发展数字化智能化渔业的背景下，工厂化循环水养殖逐渐兴起，大口黑鲈养殖模式也从传统的池塘养殖逐渐向绿色高效的循环水养殖模式转变[2-4]。循环水养殖具有节水节地、养殖密度高、管理方便等优点，通过物理、生物、化学等手段和设备，将水体中的固体悬浮物、有害物质排出或转化为无害物质，使水质满足养殖对象正常生长需要，从而实现高密度养殖条件下水体的循环利用，已在多个养殖品种中取得较好的经济效益[5]。

目前，大口黑鲈循环水养殖的研究主要围绕生长[6-7]、饲料营养[8]、品系筛选[9]、精准投喂[10]、水环境变化[11]、营养品质[12-13]等方面展开。大口黑鲈室内工厂化循环水养殖的研究主要围绕大规格苗种培育展开[14]，全阶段成鱼养殖尚未大面积推广。大口黑鲈循环水养殖面对的主要挑战是在高密度养殖条件下维持良好的水环境，保证养殖对象的正常生长。水处理是循环水养殖的核心，而高效水处理生物填料则是水处理系统的基础。虽然已有较多生物填料净化水质的报道[15-17]，但在大口黑鲈工厂化循环水养殖方面，特别是有效水处理生物填料的筛选、不同生物填料生物膜的微生物群落结构、处理效果及对养殖对象生长的影响尚未见报道。选取了3 种生物填料，其中方形海绵和流化球生物填料价格低、操作简单，已经在养殖尾水处理中广泛应用；Mutag Biochip 30（简称Biochip）是近几年出现的新型生物填料，具有耐冲击、使用寿命长的优点，但实际应用效果未见报道。为此，利用16S rDNA高通量测序技术，对3 种水处理生物填料的挂膜情况进行分析，同时对大口黑鲈生长情况进行分析，以期筛选出实用的水处理生物填料，为大口黑鲈工厂化循环水养殖提供高效的水处理填料。

1 材料和方法

1.1 试验填料

本试验选用生物填料分别为方形海绵、Biochip和流化球，如图1所示。方形海绵材质为聚氨酯，外形为边长2.0 cm 的立方体，比表面积（3.2～3.5）×104m2/m3。Biochip 材质为聚乙烯，外形为直径3.0 cm 的圆形，厚度约0.11 cm，比表面积5.5×103m2/m3。流化球材质为聚乙烯，有效比表面积500～800m2/m3。

图1 供试水处理生物填料Fig.1 Experimental biological filler

1.2 试验分组

方形海绵生物填料处理组设为T1组，对应的填料生物膜标记为B1，对应的养殖水体标记为W1；Biochip 生物填料处理组设为T2 组，对应的填料生物膜标记为B2，对应的养殖水体标记为W2；流化球生物填料处理组设为T3组，对应的填料生物膜标记为B3，对应的养殖水体标记为W3。

1.3 养殖系统

试验在浙江省淡水水产研究所八里店综合试验基地的循环水养殖系统中进行，养殖缸共9只，体积500 L，有效水体350 L。生物滤池由长80 cm、宽50 cm、高50 cm 的塑料水族箱构成，体积200 L，有效水体120 L。养殖缸和生物滤池由水泵连接形成内循环，流量3～4 L/min，并曝气增氧，水体溶氧保持在5 mg/L 以上。将生物填料随机分组，每种生物填料3 个重复，每个生物滤池投放生物填料2.0 kg，同时悬挂可缓释碳源，挂膜期间每天换水10%。初始水质指标：总氮（TN）9.41 mg/L，总磷（TP）1.02 mg/L，氨 氮（TAN）1.26 mg/L，亚 硝 酸 盐 氮（NO2--N）0.04 mg/L，高锰酸盐指数（CODMn）3.73 mg/L。

1.4 试验鱼及养殖管理

以大口黑鲈为养殖对象，试验开始前在循环水养殖系统中暂养7 d。试验于2022 年8 月11 日—9月22 日进行，为期42 d。挑选体表无伤、健康活泼的大口黑鲈进行分组，每个养殖缸放养60 尾，每天投喂2 次，投喂时间为上午7：00 和下午16：00，日投喂量约占鱼体总质量的1.0%～1.5%，试验鱼初体质量为（20.46±0.46）g。

1.5 样品采集

每2 d 采集生物滤池水样，记录水温、溶氧、pH值等指标，并测定氨氮和亚硝酸盐氮。统计投喂量、试验开始和结束时鱼的体质量及存活率。试验结束后用无菌采水袋采集每个养殖缸水体1 L，经0.22 μm 滤膜过滤后保存在-80 ℃冰箱备用。无菌方式从每个生物滤池取生物填料样品0.5 g，保存在灭菌蒸馏水中，剧烈振荡使生物膜表面的微生物脱落，再经0.22 μm 滤膜过滤后保存在-80 ℃冰箱备用。

1.6 测定方法

1.6.1 水质测定 水温、溶氧和pH 值采用哈希Hq40d 便携式水质分析仪进行检测，氨氮浓度采用纳氏试剂分光光度法测定[13]，亚硝酸盐氮浓度采用盐酸萘乙二胺分光光度法检测[14]。

1.6.2 养殖性能测定 鱼体的增重率、饲料系数和存活率的计算公式如下。

增重率=（鱼体末体质量－鱼体初体质量）/初体质量×100%；

饲料系数=饲料消耗量/增质量；

存活率=（试验结束后鱼尾数/试验初始鱼尾数）×100%。

1.6.3 微生物高通量测序 采用细菌DNA 提取试剂盒提取水体和生物膜上的细菌DNA（OMEGA Biotech 公司，美国），利用特异性引物338F（5′–ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′ –GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对 细 菌 16S rDNA 的V3 和V4 区 进 行PCR 扩 增。PCR 采 用TransGen AP221-02 反 应 体 系：5×FastPfu 缓 冲 液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、5 μmol/L 上下游引物各0.8 μL、BSA 0.2 μL、DNA 模板10 ng，补ddH2O 至20 μL。PCR 反应条件：95 ℃3 min；95 ℃30 s，53 ℃45 s，72 ℃1 min，28 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 扩增在PCR 反应仪9700（Applied Biosystems®GeneAmp®，美 国）上 进 行。PCR 产物使用Beads 纯化之后进行上机测序，测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。

1.6.4 微生物多样性分析 首先对测序得到的原始数据进行拼接，之后对reads的质量和拼接效果进行质控过滤，并校正序列方向，即为优化数据。对最终获得Clean 数据归一化之后，按照97%相似性进行OTU（Operational taxonomic units）聚类分析和物种分类学分析。样品的柱状图采用Excel 绘制，热图绘制利用美吉生物云平台完成。

1.7 数据分析

采用SPSS 16.0统计软件进行差异显著性分析，利用方差分析（ANOVA）中Duncan’s 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同生物填料的挂膜时间

由图2可知，自然挂膜条件下，生物滤池中水体氨氮含量呈快速上升后逐渐降低的趋势，方形海绵对应的生物滤池中水体氨氮含量在17 d 达到峰值，为8.13 mg/L，之后逐渐下降，41 d 降至最低，之后保持在0.20 mg/L 左右，表明方形海绵挂膜时间约为17 d。Biochip 和流化球对应生物滤池水体中氨氮含量变化趋势基本相同，呈波动变化，氨氮峰值出现 在21 d，分 别 为7.88 mg/L 和7.57 mg/L，表 明Biochip 和流化球生物填料挂膜时间约为21 d，二者对应的生物滤池氨氮含量分别在43 d 和45 d 降至最低。

图2 不同生物滤池中氨氮含量变化Fig.2 The changes of TAN in different biofilters

2.2 不同养殖缸中水体pH值变化

从图3 可以看出，养殖水体的初始pH 值为7.3，随着养殖时间的延长，各养殖缸水体的pH 值呈下降趋势，12 d 后，所有养殖缸的pH 值均小于6.0，不利于养殖对象生长。因此，挂膜12 d 后应注意调节养殖缸水体的pH值。

2.3 不同生物填料上生物膜及水体中微生物群落组成分析

2.3.1 门水平微生物群落组成 由图4 可知，在门水平，3种生物填料上生物膜的优势菌相同，均为变形 菌 门（Proteobacteria）、放 线 菌 门（Actinobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、绿弯菌门（Chloroflexi）。三者相对丰度之和分别为68.96%、64.74%、65.45%。对应的养殖水体中优势菌有所差异，W1 优势菌为放线菌门（Actinobacteriota），相对丰度为64.66%，W2和W3的优势菌为变形菌门（Proteobacteria），相对丰度分别为34.93%和50.10%。

图4 不同生物填料上生物膜及水体中细菌群落在门水平的组成Fig.4 Community composition of bacteria in different biofilm and water at phylum level

2.3.2 科水平微生物群落组成 由图5 可知，在3种填料生物膜上，约48%的细菌为相对丰度均小于3%的细菌群落。B1和B2的优势菌相同，均为黄色单胞菌科（Xanthomonadaceae），相对丰度分别为11.64%和9.16%；B3 的优势菌为JG30-KF-CM45，相对丰度为10.54%。养殖水体中的优势菌和生物填料不同，微杆菌科（Microbacteriaceae）为W1 的绝对优势菌，相对丰度为62.10%；W2的优势菌除微杆菌科（13.82%）外，还包含一定比例的根瘤菌科（Rhizobiales）（8.57%）；W3的优势菌为根瘤菌科，相对 丰 度 为 38.94%，其 次 为 黄 杆 菌 科（Flavobacteriaceae），相对丰度为15.89%。

图5 不同生物填料上生物膜及水体中细菌群落在科水平的组成Fig.5 Community composition of bacteria in different biofilm and water at family level

统计属水平排名前50 的物种，数值经处理后，通过色块颜色梯度来展示样本中不同物种的丰度变化情况，结果如图6所示。雷夫松氏菌（Leifsonia）是W1 的优势菌，相对丰度为56.16%；W2 的优势菌为雷夫松氏菌（10.30%）、根瘤菌科Incertae_sedis（8.47%）；W3 的优势菌为根瘤菌科Incertae_sedis，相对丰度为38.92%。生物膜可鉴别的细菌中，热单胞菌属（Thermomonas）是B1 的优势菌，相对丰度为4.71%；B2 和B3 的优势菌为硝化螺旋菌属（Nitrospira），相对丰度分别为4.41%、2.70%。

2.4 不同生物填料上生物膜和水体中微生物群落的α-多样性分析

由表1 可知，不同填料上生物膜微生物群落的香农指数大于对应的养殖水体，辛普森指数则相反。分析对应的养殖水体，W2 的细菌群落香农指数最高，显著高于W1 和W3，辛普森指数则显著低于W1 和W3，表明其α-多样性最高。与养殖水体的α-多样性不同，虽然B2 填料中细菌微生物群落的香农指数最大、辛普森指数最小，但3种生物填料之间无显著差异。所有样本的测序覆盖率在0.990以上，表明测序深度可以反映样本的真实水平。

表1 不同生物填料上生物膜及养殖水体的微生物多样性指数Tab.1 The microbial diversity index in different biofilm and water samples

2.5 不同生物填料对大口黑鲈生长的影响

质量和增重率显著高于流化球和Biochip组，饲料系数显著低于组。各组大口黑鲈的存活率均在97%以上，各组间无显著差异。

3 结论与讨论

3.1 不同生物填料的挂膜时间

生物膜附着于生物填料表面，生物填料的材质、结构和比表面积是影响生物膜形成的主要因素[18-20]。生物膜培养有2种常用方法，自然挂膜法和接种挂膜法，不同挂膜方法影响生物膜的成熟时间。胡小兵等[21]采用4 种不同的方法进行挂膜，结果表明，采用添加壳聚糖、铁离子、接种排泥法挂膜时，生物膜的成熟时间较自然挂膜法短。虽然添加有益微生物或活性物质可以缩短挂膜时间，但是存在接种物质获取困难、工艺构建复杂、成本高等问题[22]。管敏等[23]在低有机物含量条件下，直接采用原水进行挂膜，经过约38 d 生物滤池自然挂膜启动成功，这一研究结果与本研究结果相似。本研究结果表明，在相同的挂膜条件下，方形海绵的挂膜时间少于其他2 种生物填料，这可能与方形海绵比表面积大、亲水性强、易于生物膜附着有关。方形海绵的比表面积高达32 000～35 000 m2/m3，远大于其他2种填料。此外，方形海绵的材质为聚氨酯，遇水膨胀，亲水性高，有利于水体中微生物的附着和生长。黎镛等[24]的研究结果也表明，聚氨酯海绵的启动性能和氨氮去除性能优于聚丙烯，与本研究结果一致。另外，本研究中，Biochip 生物填料的比表面积高达5 500 m2/m3，远大于流化球生物填料，但挂膜时间和流化球填料基本相同，这可能和孔隙大小有关。有研究指出，生物填料内部空间尺度会影响生物膜的生长[24]。有的生物填料尽管比表面积大，但孔隙细小，孔径远小于成熟生物膜厚度，容易导致孔隙堵塞，从而孔隙中的生物膜量难以达到最大积累[25]。Biochip 孔隙较小，导致其生物膜生长较慢，挂膜时间较长。

3.2 生物填料及养殖水体的微生物群落组成

本研究中，生物填料和对应养殖水体中的优势菌不同，生物填料上生物膜的香农指数大于对应养殖水体，说明生物填料具有富集微生物的作用，这与胡高宇等[26]的研究结果一致。影响微生物群落结构的因素众多，如载体类型[27]、滤池深度[28]、盐度[29]、有机物浓度[30]等。同一种生物填料，在不同养殖条件下，生物膜上的微生物群落也不相同。笔者曾对流化球生物填料在罗氏沼虾循环水养殖系统中的挂膜情况进行研究，结果表明，其生物膜上的优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes）[31]，而本研究中流化球生物膜上的优势菌门为变形菌门（Proteobacteria），造成这种差异的主要原因可能是养殖环境不同。本研究采用的3 种生物填料，培养生物膜的初始条件相同，可能由于填料的物理特性不同，形成的生物膜厚度和内环境也不同，造成了微生物群落的差异，因此，载体不同是造成微生物群落差异的主要原因。此外，养殖过程中水环境与微生物群落之间相互影响，微生物群落差异的原因可能和环境因子有关。如袁翠霖[32]的研究表明，pH 值能显著影响水体异养细菌总数；范廷玉等[33]认为，总氮含量在内河河段的水生细菌群落分布中起关键作用，氨氮、总磷以及叶绿素a也在不同程度上影响着水体中的细菌群落组成。本研究中造成微生物群落组成差异的环境因子仍需进一步确认。

3.3 不同生物填料对大口黑鲈生长的影响

从生长结果看，方形海绵组大口黑鲈生长最快，增重率显著高于其他2 种填料，且饲料系数最低。这与前人[34-35]研究结果一致。本研究中，边挂膜边养殖，从挂膜时间来看，方形海绵生物膜较早成熟，且生物膜成熟后水体中的氨氮和亚硝酸盐氮浓度一直低于其他2 种填料。另外，方形海绵具有一定的过滤能力，养殖水体中固体悬浮物的含量较低，水体较为清澈，方形海绵组大口黑鲈生长较好可能与良好的水质有关，但方形海绵填料对水体总氮、总磷和高锰酸盐指数的净化效果有待进一步研究。值得注意的是，在试验过程中，pH 值整体呈下降趋势，养殖12 d 后，所有养殖缸的pH 值均小于6.0，与张龙等[28]的研究结果一致。pH 值降低是因为培养生物膜的过程中，有大量氢离子产生，导致水体pH 值下降。因此，挂膜过程中要及时调节养殖缸水体的pH 值，保证其在养殖对象正常生长范围内。从经济成本考虑，方形海绵市场价在70～100元/kg，成本介于其他2 种生物填料之间，结合生长结果，短期内方形海绵是一种较为实用的循环水养殖水处理生物填料，但方形海绵韧性较差，使用寿命较短，长期的使用效果和养殖效果有待进一步验证。

综上，在自然挂膜条件下，方形海绵生物填料的挂膜时间最短，价格适中，且方形海绵组大口黑鲈的末体质量和增重率显著高于其他2 种生物填料，短期内是一种较为实用的循环水水处理生物填料。

致谢：浙江大学舟山海洋研究中心郑刚老师为本研究提供了可缓释碳源，特此致谢。