链格孢毒素化学结构、毒性效应和检测方法研究进展

王 冉，李欲轲，乙 引，唐 明

（1.贵州师范大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州师范大学 西南喀斯特山地生物多样性保护国家林草局重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州师范大学 贵州省植物生理与发育调控重点实验室，贵州 贵阳 550025）

链格孢（Alternariasp.）是自然界中普遍存在的真菌，包括腐生菌、内生菌[1]。链格孢目前已被报道300 多个种，如互隔链格孢（Alternaria alternata）、细极 链 格 孢（Alternaria tenuissima）、树 栖 链 格 孢（Alternaria arborescense）、芸 薹 链 格 孢（Alternaria brassicicola）和茄链格孢（Alternaria solani）等，由于链格孢寄主范围大（在世界范围内分布），危害多种谷物、蔬菜、水果和经济作物（如小麦、大豆、番茄、柑橘、梨、油葵、烟草等），造成了巨大的经济损失[2-8]。另外，链格孢还会引起收获后的谷物发生病害，从而引起人类过敏性鼻炎和特应性哮喘[9-11]。

链格孢毒素（Alternariatoxin）是链格孢真菌致病种产生的具有不同化学结构的小分子次级代谢产物，目前已经鉴定出70 多种，这些毒素通常表现出多种生物活性，如植物毒性、遗传毒性、细胞毒性和抗菌特性等[12-13]。链格孢毒素是链格孢重要的致病因子，对叶绿体、线粒体、质膜、细胞核、高尔基体等多种细胞器有负面影响[14]。链格孢毒素可以通过细胞膜、叶绿体和线粒体功能障碍等方式影响细胞正常生长代谢过程[15-17]；通过抑制与脱氧核糖核酸（DNA）超螺旋调节有关的拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ的活性，参与细胞的复制、转录和修复等过程[18]；在核糖体水平上抑制蛋白质的生物合成[19]，最终导致植物患病甚至死亡。

根据链格孢毒素对宿主作用的特异性差异，可将链格孢毒素分为宿主特异性毒素（Host-specific toxin，HST）和宿主非特异性毒素（Non-host-specific toxin，nHST）[20]。HST 能够在植物病原体特异性的宿主范围起作用，只有宿主的特定基因型对毒素敏感，因此，仅对宿主有毒，而对大多数其他植物无害。nHST 可以影响包括产生毒素病原体的宿主和非宿主在内的许多植物。大多数HST 被认为是链格孢入侵组织和致病所需的致病因子，导致发病加重和病原体增殖[21]。

链格孢毒素的毒性作用尚未被系统阐明。目前，关于链格孢毒素的综述主要聚焦于链格孢毒素合成相关基因、致病机制等，关于链格孢毒素的化学结构、毒性效应等方面报道较少。鉴于此，拟综述多种重要的链格孢毒素化学结构、毒性效应、靶向位点以及检测技术研究进展，以期为毒素结构改造和检测方法开发提供理论依据。

1 链格孢宿主特异性毒素的化学结构和毒性效应

1.1 链格孢宿主特异性毒素的化学结构

不同链格孢特异性毒素在寄主植物致病过程中具有不同的作用方式、生化反应和信号机制[20]。链格孢HST根据化学结构不同可分为7类：（1）环氧癸三烯酸类（AK-toxin、AF-toxin 和ACT-toxin）；（2）鞘 氨 醇 类 似 物 类（AAL-toxin）；（3）吡 喃 酮 类（ACR-toxin）；（4）环肽类（AM-toxin、Destruxin B 和HC-toxin）；（5）四肽类（AS-I toxin）；（6）核糖体肽类（ABR-toxin）；（7）二酮哌嗪类（Maculosin）。其化学结构、化学式和靶向位点如表1所示。

续表1 链格孢产生的宿主特异性毒素的化学结构、化学式和靶向位点Tab.1（Continued）Chemical structure，chemical formula，and target site of host-specific toxins produced by Alternaria

1.2 链格孢宿主特异性毒素的毒性效应

AK-toxin、AF-toxin 和ACT-toxin 属于环氧癸三烯酸类毒素。研究表明，AK-toxin 是从日本梨黑斑病发现的链格孢毒素[23]，能够造成易感宿主质膜的破坏，引起钾离子（K+）外流，导致未成熟果实脱落。AF-toxin 是从草莓黑斑病发现的链格孢毒素[24]，会引起细胞质膜上的钾离子（K+）渗漏，还影响质膜氢离子转位ATP 酶（H+-ATP 酶）的功能[17]。ACT-toxin是从柑橘褐斑病发现的链格孢毒素[25]，被确定是柑橘类植物的主要宿主特异性毒素，对柑橘类植物具有极强的致病性，会在橘子的嫩叶、树枝和果实上造成褐色或黑色斑点，也可以通过叶脉传播并导致更严重的损伤[14]。AF-toxin、AK-toxin 和ACT-toxin的毒性效应相似，靶向位点都是质膜，能够引起膜内陷、泡状形成、碎裂和去极化，导致膜电位梯度降低，诱导易感细胞坏死，增加易感细胞区室质膜上的K+流出，造成钾渗漏，引起高尔基体囊泡与受损的质膜融合[26]。

AAL-toxin属于鞘氨醇类似物类毒素，最早发现于番茄，是番茄链格孢致病菌引起番茄茎部溃疡病产生的毒素[27]。AAL-toxin 是鞘氨醇霉菌毒素（SAMT）的类似物，SAMT 诱导的程序性细胞死亡（PCD）的潜在机制与神经酰胺合酶的竞争性抑制有关，AAL-toxin 能够抑制二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇和其他游离鞘氨醇碱基转化为神经酰胺的过程，游离鞘氨醇碱基的积累会激活PCD 转导途径，最终造成细胞程序性死亡[28]。

ACR-toxin属于吡喃酮类毒素，最早发现于患叶斑病的粗柠檬[29]，会造成线粒体中嵴和囊泡的破坏，并在膜上形成孔洞[30]。ACR-toxin 还会引起线粒体氧化磷酸化与线粒体电子传递链的解偶联和膜电位的丧失，使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）从三羧酸循环（TCA）中退出[31]。

AM-toxin、Destruxin B 和HC-toxin 属于环肽类毒素。AM-toxin 是从苹果叶斑病发现的链格孢毒素[32]。AM-toxin 有质膜和叶绿体2 个主要作用部位，被毒素作用后，质膜和叶绿体中的颗粒片状结构以宿主特异性的方式呈现，质膜破坏造成细胞中细胞液渗出；利用放射性标记的二氧化碳（CO2）研究AM-toxin 对叶绿体影响的研究结果表明，毒素处理过的苹果植株能够抑制CO2的氧化作用[33]。Destruxin B 最早从芸薹属植物中分离[34]。Destruxin B 会引起甘蓝褪绿病和细胞坏死，电子显微镜下褪绿病植株细胞具有正常的质膜，但线粒体肿胀，嵴数量减少，包膜出现水泡，叶绿体随着质体球数量的增加显示出颗粒微结构的退化，坏死细胞出现质壁分离和细胞器完全破坏[22]。Destruxin B 具有抗病毒活性，CHEN 等[35]的研究发现，Destruxin B 能够抑制人类肝癌Hep3B 细胞中乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg基因的表达，未来可能具有作为特异性抗肝癌药物的发展潜力。HC-toxin 最早发现于美国北方患叶斑病的玉米，玉米圆斑病菌是主要病原菌[36]，0.5～2.0 μg/mL 等低剂量的HC-toxin 可以抑制易感玉米的根系生长[37]。除了植物毒性之外，HC-toxin还能够抑制哺乳动物细胞中使核心组蛋白（H3 和H4）去乙酰化的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性[38]。

AS-I toxin 属于四肽类毒素。AS-I toxin 最早从链格孢的培养滤液中分离，经化学和物理化学技术鉴定，其为四肽。AS-I toxin 能够造成向日葵叶片和其他部分的萎黄或坏死，抑制种子发芽[39]。目前，关于AS-I toxin的研究很少，需要进一步详细研究。

ABR-toxin属于核糖体肽毒素，最早从芸薹属植物甘蓝叶片上的孢子萌发液中分离纯化得到。进一步的研究表明，将ABR-toxin 与非致病性的链格孢孢子混合液接种到芸薹属植物叶子上时，植物的叶子上出现褐色斑点，随后出现与芸薹链格孢感染症状相似的褪绿症状，ABR-toxin不仅诱导寄主植物的初始定殖，而且参与病害的发展过程[34]。目前，关于ABR-toxin 的报道较少，尚不清楚毒素的作用位点和毒性效应。

Maculosin 属于二酮哌嗪类毒素。斑点矢车菊（Centaurea maculosa）是北美主要杂草，对牧草生产具有很大破坏作用。Maculosin 是互隔链格孢侵染兰科植物后分离获得，被确定是斑点矢车菊上的主要HST，造成斑点矢车菊黑叶枯萎病[40]。Maculosin的靶向位点是叶绿体，有潜力成为一种安全、环保的抗杂草生物除草剂[21]。目前，关于Maculosin 生物合成途径尚未有报道。

2 链格孢宿主非特异性毒素的化学结构和毒性效应

2.1 链格孢宿主非特异性毒素的化学结构

链格孢宿主非特异性毒素的毒性作用比特异性毒素更复杂。根据毒素的化学结构特征可将nHST 分为4类：（1）二苯并吡喃酮类衍生物类，如交链格孢酚单甲醚（Alternariol monomethyl ether，AME）、交链格孢酚（Alternariol，AOH）；（2）四氨基酸衍生物类，如细交链格孢酮酸（Tenuazonic acid，TeA）；（3）环状四肽类，如腾毒素（Tentoxin，TEN）；（4）苝醌衍生物类，如交链格孢毒素（ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ、ATX-Ⅲ）。其化学结构、化学式和靶向位点如表2所示。

表2 链格孢产生的宿主非特异性毒素的化学结构、化学式和靶向位点Tab.2 Chemical structure，chemical formula，and target site of non-host-specific toxins produced by Alternaria

2.2 链格孢宿主非特异性毒素的毒性效应

AME 和AOH 属于二苯并吡喃酮类衍生物类毒素。研究表明，AME 能够抑制植物叶绿体光合作用过程中的电子传递[44]。AOH 会引起意大利苍耳的叶斑病，其毒性能够抑制单子叶植物狼尾草、双子叶植物紫叶苜蓿和反枝苋根系的增长[45]。WENDEROTH 等[46]的研究发现，AOH 及其衍生物作为毒力因子感染番茄，并参与其定殖过程。还有研究表明，对于动物细胞，AME 和AOH 具有致突变性、基因毒性和雌激素活性，能够抑制人类癌细胞（HT29、A431）的拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ的活性，影响细胞的复制、转录和修复过程[47]。AOH和AME在交链孢酚-O-甲基转移酶的作用下可以相互转化[48]。由于AOH 芳族羟基化的所有产物是儿茶酚或对苯二酚，它们可以产生反应性半醌和醌进行氧化还原循环，因此，其甲基化或葡萄糖醛酸化/硫酸化的失活被认为是可能的毒理学原因[49]。AOH 可能通过阻断细胞周期、减少细胞增殖和增加细胞凋亡干扰哺乳动物增殖细胞的正常进程，引起细胞毒性作用[50]。AOH 在哺乳动物中通过产生活性氧（ROS）和脂质过氧化（LPO）诱导强烈的氧化应激，从而降低人结肠腺癌细胞（Caco-2）的活性[51]。AOH 激活芳香烃受体（AhR）和核因子E2 相关因子2（Nrf2）的核易位，控制细胞代谢能力和结构完整性，通过控制细胞结构影响结肠上皮完整性[43]。

TeA 属于四氨基酸衍生物类毒素，最早于棉花中分离得到，随后在多种谷物、蔬菜和水果病害中分离得到[21]。TeA 通过抑制60S 核糖体亚基释放新合成的蛋白质，因此，能够在核糖体水平上抑制蛋白质的生物合成[20]。TeA 可以通过抑制光系统Ⅱ（PSⅡ）受体侧的电子传递和叶绿体ATP 酶活性引起叶绿体来源的ROS 暴发，导致植物细胞死亡和组织坏死[52]。进一步的研究表明，TeA 诱导的单线态氧激活了蛋白质依赖性信号通路并引发了拟南芥幼苗中的细胞死亡[53]，SHI 等[54]的研究发现，野生型链格孢可以诱导宿主叶片中的ROS 暴发并在菌丝入侵之前杀死光合细胞。由TeA 引发的细胞死亡是病原体感染期间在宿主叶片中成功定殖和引起病害的必要条件。KANG 等[55]的研究发现，TeA 不仅会对寄主植物造成损害，而且还参与维持ROS 含量、宿主识别、诱导附着胞感染宿主和完成感染过程。

TEN 属于环状四肽类毒素，最早于紫茎泽兰枯萎叶片中分离得到[56]。TEN 是一种特异性的、非竞争性的光磷酸化抑制剂，作用部位与叶绿体F1-ATP酶（CF1）有关[57]。SANTOLINI等[58]的研究表明，低浓度的TEN 会抑制ATP 的水解和合成，高浓度的TEN会影响ATP酶的活性。

ATX 属于苝醌衍生物交替毒素。ATX-Ⅰ和ATX-Ⅱ最早从链格孢苹果专化型（A.mali）中分离，ATX-Ⅲ从互隔链格孢（A.alternata）分离[59]。目前，对于ATX 毒素的研究主要集中于对哺乳动物的毒性效应，在植物中的靶向位点和致病机制尚不清楚。研究表明，ATX 对动物细胞的诱变强度要高于AOH 和AME[60-63]。ATX 对宫颈癌HeLa 细胞和中国仓鼠肺细胞株V79 均具有细胞毒性[59，62]。ATX-Ⅱ诱导AhR 和Nrf2 的核易位，在细胞因子转录和蛋白质水平上抑制肠道免疫反应，通过控制细胞结构影响结肠上皮完整性[43]。

3 链格孢毒素检测方法

准确、迅速、高效的检测技术是链格孢毒素研究的基础。目前，链格孢毒素检测方法有高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-串联质谱法、加压毛细管电色谱法、酶联免疫吸附法、生物发光酶免疫测定法、薄层色谱法等。

高效液相色谱-串联质谱法（High performance liquid chromatography mass spectrometry，HPLC-MS/MS）利用高效液相色谱对复杂样品进行分离，质谱提供链格孢毒素相对分子质量与结构信息。HPLC-MS/MS 具有灵敏度高、操作方便、自动化等优点，近年来广泛用于毒素的定性和定量测定。GUO 等[64]开发了一种改进的基于快速、简便、便宜、有效、坚固、安全的萃取方法（Quick，easy，cheap，effective，rugged and safe simple，rapid and safe method，QuEChERS）的超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）方法，测定果汁中常见的曲霉、青霉和链格孢毒素发现，其中5 种链格孢毒素[TEN、TeA、AOH、AME、链格孢烯（ALT）]的检测限（LOD）为0.05～0.50 ng/mL，定量限（LOQ）为0.1～1.0 ng/mL。RAUSCH 等[65]使用基于QuEChERS 的萃取方法，在不同条件下进行HPLC-MS/MS分析，测定38种真菌毒素发现，小麦中4 种链格孢毒素（ALT、AME、AOH、TEN）的LOD 为0.01～0.30 μg/kg，LOQ 为0.40～1.50 μg/kg。XING 等[66]使 用 改 进 的QuEChERS 方法，用乙腈和水萃取，用NaCl 盐析，测定果泥中7 种链格孢毒素发现，其LOD为0.18～0.53 μg/kg，LOQ为0.56～2.17 μg/kg。SCHEIBENZUBER 等[67]建立了一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，测定不同啤酒类型中13 种游离和改性的链格孢毒素发现，AME和ALT的LOD 在0.03 ～5.48 μg/L，LOQ 在0.09～16.24 μg/L。但HPLC-MS/MS 缺点在于仪器价格较为昂贵，测定成本较高；存在基质效应等缺点，需要进行固相萃取等复杂前处理，改善净化效果，降低基质效应。

气相色谱-串联质谱法（Gas chromatography mass spectrometry，GC-MS/MS）利用样品的沸点或极性的差异对真菌毒素进行分离。GC-MS/MS具有分离度高、灵敏度高和应用范围广等优点，SCOTT 等[68]利 用 衍 生 化GC-MS/MS 和HPLC 2 种 方法同时测定苹果汁中的链格孢毒素，经分析比较发现，GC-MS/MS 的灵敏度高于HPLC。GC-MS/MS 适用于非极性、半极性、挥发性和半挥发性化合物的检测，但大多数链格孢毒素是低挥发性的极性小分子，因此，GC-MS/MS检测前通常要对链格孢毒素样品进行衍生化处理。衍生化处理会出现基质干扰和耗时长等不可避免的问题，检测结果重复性差。此外，GC-MS/MS 还存在前一个样品进样的记忆效应问题。因此，GC-MS/MS 在链格孢毒素检测领域应用较少。

加压毛细管电色谱法（Pressure capillary electrochromatography combined，pCEC）是结合毛细管电泳的高柱效性和高效液相色谱的高选择性的新型电动微分离技术，具有快速、准确、灵敏、检出限低和重现性好等优点[69]。薛羚伟等[70]利用pCEC技术对霉变柑橘中的AME、AOH 和ALT 3 种链格孢毒素进行测定，LOD 为0.1～0.9 μg/kg，LOQ 在0.2～0.9 μg/kg。但是pCEC 分析复杂样品时，数据的准确性以及方法灵敏度易受基质效应的影响。

酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是利用抗体三维结构特点区分毒素的方法。酶联免疫吸附试验试剂盒样本量要求低，而且通常样本量更少，具有快速、简单、特异、灵敏、便携的特点。缀合物的设计是一种创新的合成策略，缀合物是通过非共价作用或共价键对蛋白质进行修饰得到的，可以有效调控蛋白质的稳定性和功能性[71]。SZURDOKI 等[72]开 发 了 合 成AAL-toxin TA 蛋白缀合物的新方法。选择的缀合物是制备检测AAL 毒素的单克隆抗体和多克隆抗血清的候选免疫原。用缀合物免疫小鼠，所得多克隆抗血清用于设计AAL 化合物的类别选择性ELISA。检测限在十亿分之几的低范围内，对许多结构相似的化合物（包括伏马菌素B1 和鞘氨醇）没有显著的交叉反应性。利用缀合物作为候选免疫原，可产生单克隆抗体和多克隆抗血清，AAL-toxin 是第1 个通过ELISA检测到的链格孢毒素。LIANG 等[73]以TeA 为靶点，基于产生抗TeA 单克隆抗体的杂交瘤细胞（3F10）的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），开发了针对链格孢毒素TeA 的增强型开放夹心酶联免疫吸附法（Open sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，OS-ELISA）抗体，LOD 为0.08 ng/mL，灵敏度是基于单克隆抗体间接竞争ELISA 的13倍，利用该方法检测果汁、面粉和番茄酱样品中的TeA 含量，回收率为87.6%～111.3%，OS-ELISA 可以作为TeA检测的一种新颖可行的分析方法。但酶联免疫吸附法具有重现性差、抗体制备不易的缺点，有时候会有假阳性等情况发生，因此，在链格孢毒素检测方面受到限制。

生物发光酶免疫测定法（Bioluminescent enzyme immunoassay，BLEIA），是将高灵敏的生物发光分析与特异性的酶联免疫技术相结合的测定方法，可消除含有剧毒的毒素标准品存在的安全隐患，且不需要标准品，降低检测成本。WANG等[74]以链格孢毒素TeA 为靶点，基于铁蛋白显示的抗独特型纳米体-纳米荧光素酶多聚体，建立了一种增强的无毒免疫分析法（Non-toxic direct competitive bioluminescent enzyme immunoassay，dc BLEIA）。dc BLEIA 以具有特殊内部图像的β 型抗独特型抗体作为抗原的替代品。增强型dc BLEIA 的LOD 为0.7 ng/mL，回收率在80.0%～93.2%，与传统仪器方法相比，基于抗体的免疫测定具有快速、高灵敏度、高特异性、高通量和安全性的优势，但只限于单一毒素的检测。

薄层色谱法（Thin layer chromatography，TLC）是在紫外光线照射下，根据毒素产生的荧光的强弱和斑点的大小对毒素的种类和含量进行测定[75]。TLC具有成本低、溶剂消耗少、样品预处理和操作简单以及显影快等优点。HASAN[76]使用氯仿-丙酮作为溶剂，对番茄中的链格孢毒素进行TLC 测定，结果表明，腐烂番茄中的主要链格孢毒素为AOH、AME和TeA，LOD 分别为100、100、700 μg/kg。与其他检测方法相比，TLC存在检出限较高、重现性差和误差大等缺陷。

综上，TLC、GC-MS/MS 等传统分析检测方式存在检出限高和需要衍生化处理等缺点；HPLC-MS/MS 灵敏度和自动化程度较高，但是仪器较为昂贵且体积较大，不能进行实时测定；pCEC 具有准确、快速和灵敏等优点，但存在易受基质效应影响等缺点；ELISA 回收率高，方便携带，但抗体制备要求较高且困难，假阳性情况时有发生；dc BLEIA 具有检出限低、灵敏、快速、安全、方便等优势，是今后研究的热点。检测仪器体积小、快速、灵敏、操作简便、低成本将是未来链格孢毒素检测技术的发展趋势。

4 展望

链格孢毒素被公认为是植物致病性的重要决定因素，在各种链格孢的致病机制中起着关键作用。目前，链格孢宿主非特异性毒素的合成相关基因已经有较多研究报道，但是多种宿主特异性毒素合成相关基因和作用通路尚不明确。未来应进一步挖掘毒性靶标基因和抗性机制，重点研究系统中各种影响因素的调节过程，深入了解毒素代谢途径，助力抗病植物品种的开发。

由于链格孢毒素在植物上广泛存在，并被动物和人类食用，因此，需要对其进行更多的毒理学和毒性动力学研究。目前的链格孢毒素研究大多仅限于体外试验，人们对链格孢毒素的毒性动力学知之甚少。新的研究结果表明，链格孢毒素和肠道微生物之间存在实质性的相互作用[77]，这一方面可能会影响肠道微生物组成，另一方面可能会影响毒理学和毒性动力学。未来需要在体内应用创新稳定同位素辅助代谢组研究[78]，以详细揭示链格孢毒素在体内的代谢过程。新开发的LC-MS/MS方法能够同时检测多种链格孢毒素[79]，预计将广泛应用于食品和饲料中目前尚未充分评估的具有潜在毒理学相关性的代谢物的检测。

在目前的全球真菌毒素的限量标准中，与农产品相关的标准尚未包括链格孢毒素[80]。因此，有必要制定符合中国国情的相关标准和法规，有效控制污染的谷物、水果及其衍生产品中的链格孢毒素，保证食品安全。