高效液相色谱-串联质谱法检测鸡蛋中多西环素药物残留

2023-04-15朱莉莎徐飘飘向文婷欧亚红梁继翔彭大鹏

湖北畜牧兽医 2023年3期

张美，朱莉莎，徐飘飘，曾婧，向文婷，欧亚红，梁继翔，彭大鹏

（1.武汉工控检验检测有限公司，武汉 430030；2.华中农业大学动物科学技术学院动物医学院，武汉 430070）

四环素类是由链霉菌产生的一类价格低廉、抗菌活性高的广谱抗菌素，包含四环素、土霉素、金霉素、多西环素（Doxycycline）、强力霉素、脱氧土霉素等［1］。其中，多西环素广谱高效且价格低廉，是蛋鸡养殖中使用较多的四环素类药物，主要用于大肠杆菌病、沙门氏菌病、慢性呼吸道疾病等疾病的防治［2，3］。为保障食品安全，2019 年农业农村部联合国家卫生健康委员会和国家市场监督管理总局发布了食品中兽药最大残留限量的食品安全国家标准，规定了四环素类在家禽的肝、肾、皮肤和肌肉的最大残留限量分别为300、600、300、100 μg/kg，蛋鸡产蛋期禁止使用相关药物［4］。

鸡蛋营养丰富且价格低廉，是人类重要的动物源性食品［1］。在蛋鸡的饲养过程中部分养殖户在经济利益的驱动下没有规范使用兽药、饲料和垫料等，鸡蛋中药物残留超标的事件时有发生，造成食品安全隐患［5］。杨欢春等［6］研究报道，2016—2017 年宁夏回族自治区市售鸡蛋和鸡肉样品抽检中均发现了四环素药物类抗生素残留超标。孙言凤等［7］研究发现，2016—2018 年湖北省抽检的538 份鸡肉和鸡蛋样品中多西环素残留超标率达12.8%。2012 年欧盟多国兽药残留监测均发现有多西环素残留超标的现象［8］。

国内外报道了多种用于检测动物源性食品中多西环素残留的检测方法，如高效液相色谱法［9-11］和液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）方法［12，13］。此类检测方法多集中于猪肉、鸡肉、鱼肉等动物可食性组织［14］。本研究以食品安全关注度高的鸡蛋为材料，探究建立了一种检测鸡蛋中多西环素药物残留的灵敏度高、重现性好、操作便捷的HPLC-MS/MS检测方法，为快速、灵敏地检测鸡蛋中多西环素药物的残留提供参考。

1 材料与方法

1.1 试药

乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）、NaOH、NaH2PO4、柠檬酸和草酸均购自中国医药集团有限公司；多西环素（DOTC）标准品购自中国兽医药品监察所；鸡蛋市售；去离子水。试验于2018年11月至2019年5月进行。

1.2 主要仪器

SHIM AD ZU20A 型高效液相色谱仪，日本岛津公司；HH 型恒温水浴锅，湖北琴台医疗器械厂；TGL-16B 型冷冻高速离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；N-EVAPTM111 型氮吹仪，美国路易公司；CPA225D 型分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；API5000 型三重四级杆质谱仪，美国Applied Biosystems 公司；WX-80A 型旋涡混合器，北京六一仪器厂；KQ3200 型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试剂配制

1.3.1 Na2HPO4溶液的配制准确称取Na2HPO471.63 g，加去离子水溶解，定容于1 000 mL 容量瓶中，得到0.2 mol/L Na2HPO4溶液。

1.3.2 0.1 mol/L 柠檬酸溶液配制准确称取柠檬酸21.01 g，加去离子水溶解，定容于1 000 mL 容量瓶中，得到0.1 mol/L 柠檬酸溶液。

1.3.3 Na2-EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液取625 mL的0.2 mol/L Na2HPO4溶液加入1 000 mL 0.1 mol/L 柠檬酸溶液中，混合均匀，用稀HCl 或NaOH 调节pH至4.0±0.05；准确称取60.50 g Na2-EDTA 加入其中，充分搅拌使其溶解。

1.3.4 多西环素储备液用甲醇将多西环素配成浓度为1 mg/mL 的标准储备液，-20 ℃避光保存，有效期为2 个月。

1.4 样品制备

取适量的新鲜鸡蛋去壳，混匀后于-20 ℃下保存备用。

1.4.1 提取准确称取均质后的鸡蛋样品1.00 g 置于10 mL 离心管中，加入1.5 mL Na2-EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液，涡旋1 min，再加入4.5 mL 乙腈溶液，振荡10 min；室温条件下超声振荡15 min，4 ℃条件下10 000 r/min离心10 min，取上清液于新的10 mL离心管中，得到空白基质溶液。

1.4.2 净化选择相应的固相萃取柱无需活化，取“1.4.1”制备的上清液3 mL 过柱，收集滤液于10 mL离心管中，40 ℃水浴条件下氮气吹干，再用初始比例的流动相溶液作为复溶液0.5 mL 溶解，经0.22 μm滤膜过滤，取过滤液待后续试验。

取6 份空白鸡蛋样品，经提取纯化后，加入适量的多西环素标准储备液，制成浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/kg 和10.0 μg/kg 的基质匹配标准溶液上机检测，绘制基质匹配标准曲线，得到回归方程和相关系数。

1.5 色谱条件

色谱柱为Waters Acquity Uplc BEH C18（2.1 mm ×50 mm，2.5 μm），固相萃取柱为waters prime HLB 200 mg/6 mL，滤膜为0.22 μm，流速为0.2 mL/min，进样量为10 μL；流动相A 相：0.1%甲酸水溶液；B 相：乙腈。梯度洗脱程序见表1。

表1 多西环素梯度洗脱条件

1.6 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）模式：正离子电离模式（ESI+）扫描，多离子反应监测（MRM）模式，离子源温度250 ℃，雾化气流速3.0 L/min，加热气流速10.0 L/min，加热模块温度400 °C，干燥气流速10.0 L/min，氩气17.0 kPa，其他多西环素质谱参数如表2 所示。

表2 多西环素质谱参数

1.7 线性范围的确定

分别用甲醇和空白基质溶液稀释多西环素储备液，得到多西环素浓度为10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/kg的标准工作液，待上机检测。

1.8 准确度与精密度

在空白基质溶液中加入多西环素标准储备液，分别制备多西环素浓度为10.0、3.0 μg/kg和1.0 μg/kg的添加样品，按上述处理步骤进行残留测定。将测定浓度与药物理论添加浓度进行比较，得到药物添加回收率，每个添加水平平行测定6 次，得到其相对标准偏差。以回收率表示方法的准确度，相对偏差表示精密度。

2 结果与分析

2.1 线性范围的确定

标准溶液标准曲线和鸡蛋基质匹配标准曲线分别为y= 137 782x+152 808 和y= 135 699x+150 714（图1）。二者线性范围均在0.5～10.0 μg/L，相关系数R2均大于0.990 0。可见样品基质影响较小，可以直接通过标准溶液曲线计算回收率。

图1 多西环素标准溶液曲线与鸡蛋基质匹配曲线

2.2 检测限与定量限

空白基质溶液中添加药物后经试验得到特征离子色谱信噪比，本方法实际检测限为0.5 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。

2.3 准确度与精密度

在3 个加标水平上，多西环素的平均回收率为85.4%～93.1%，平均相对标准偏差（RSD）小于15%（表3）。结果表明，本方法回收率较高，重复性好。

表3 多西环素在鸡蛋样品中的回收率

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

不同的色谱柱对药物的保留时间会有不同，预试验对已经报道的Waters Acquity Uplc BEH C18［15］和Hypersll GOLD C18［16］色谱柱进行比较，发现Waters Acquity Uplc BEH C18 对多西环素的分离度更好，响应值更高。因此，本研究选择Waters Acquity Uplc BEH C18 色谱柱。

3.2 流动相的选择

流动相体系会影响样品分离的效果。参考文献［17-19］，预试验分别比较了磷酸-甲醇、甲酸-甲醇、三氟乙酸-甲醇、磷酸-乙腈、甲酸-乙腈和三氟乙酸-乙腈这6 种不同流动相体系。结果表明，甲酸-乙腈为流动相时梯度洗脱效果最佳，能够很好地解决色谱峰拖尾现象，保留时间良好，柱压也较低。因此，本研究选择甲酸水-乙腈作为流动相，同时在最初的梯度中保持较高的水相比例，使目标物得以充分保留。

3.3 提取试剂的选择

四环素类药物属于酸碱两性物质［20］，其在弱酸性溶液中较为稳定，在碱性、中性或强酸性溶液中均易与金属离子、蛋白质络合［11］。卜晓娜等［14］研究表明，Na2-EDTA-Mcllvaine 缓冲液为弱酸性溶液，提取四环素类药物效果较好。此外，还有采用按比例混合的甲醇乙酸水［21］、0.01 mol/L Na2-EDTA 溶液和0.3%磷酸溶液［22］等作为提取液的报道。由于鸡蛋中富含蛋白质及磷脂，故本研究采用乙腈和Na2-EDTA-Mcllvaine 缓冲液作为提取液，当有机相比例达80%时，达到了最佳提取效果。

3.4 净化条件的优化

因动物组织中含有大量蛋白质、脂肪等物质，为了避免对色谱仪器的损害以及减少杂质的干扰，通常需要对目标分析物进行净化。预试验比较了MAX、HLB、prime HLB、C18 和液液萃取的净化效果［11，18，23］。结果表明，液液萃取处理方法相对简单，但样品回收率不稳定、回收率低，不能满足要求。本研究选用Waters prime HLB 固相萃取柱，无需活化，提取净化方便，回收率及稳定较高，可以满足本试验要求。