慢性阻塞性肺疾病动物模型肺组织病理评价方法研究进展

田燕歌 刘学芳 陈锴 苗玉芳 赵高远

(河南中医药大学 1呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450046；2河南省中医药防治呼吸病重点实验室；3中医药科学院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种可预防和治疗的疾病，以气道和肺泡异常导致的持续呼吸道症状和气流受限为特征〔1〕。COPD发病率、致残率均高，社会经济负担重，使其成为世界范围内重大课题，针对发病机制、药物作用机制的基础研究占据目前COPD研究的重要地位，以大鼠为代表的动物模型也得到广泛应用〔2〕。肺组织病理是判定COPD最直观的指标，故动物实验中将其作为造模成功的标志及判定药物疗效的标准。目前研究中肺组织病理的评价方法各不相同，有描述法、定量分析法、评分法等，本文将其进行总结，为COPD的基础研究提供病理分析方面的借鉴。

1 肺组织病理的染色方法

肺组织由肺实质和肺间质组成，肺实质包括导气部和呼吸部，导气部由肺内的支气管、小支气管、细支气管和终末细支气管组成；呼吸部由呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡组成，两者共同承担肺的通气功能；肺间质是肺泡之间的结缔组织及其内包含的神经、血管和淋巴管等。COPD肺组织病理改变主要涉及肺泡结构、支气管结构及肺间质改变，目前常用的染色方法主要有苏木素-伊红(HE)染色法、Masson染色、阿辛蓝过碘酸-雪夫(AB-PAS)染色等。HE染色为常规染色方法，能较好地显示组织结构和细胞形态，且切片可长期保存。其原理为苏木素是碱性染料，可将细胞核染成蓝紫色，伊红是酸性染料，可使多数细胞质、肌纤维染成红色，由此可较为清晰看到肺泡、支气管、肺血管及肺间质结构。Masson染色即胶原纤维染色法，主要用于区分胶原纤维和肌纤维，其染色原理为小分子量易穿透结构致密、渗透性低的肌组织，而大分子量的淡绿或苯胺蓝则只能进入结构疏松的、渗透性高的胶原组织，故可将肌纤维呈红色，胶原纤维呈绿色或蓝色，可直观观察到胶原沉积情况。AB-PAS染色主要染色糖原和多糖，可用于评价气道黏液分泌程度，其原理为胞质内存在糖原或多糖类物质(如黏多糖、黏蛋白、糖蛋白等)中乙二醇基(CHOH-CHOH)经过碘酸氧化，转变成二醛基(CHO-CHO)，与雪夫试剂中无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于细胞内多糖处。

2 COPD肺组织病理的评价方法

肺组织病理能反映肺泡、小气道结构及肺间质的变化，评价方法包括形态的描述及对气道、肺泡的定量分析，定量分析可补充形态描述的不足，更为清晰准确地反映肺组织病理变化。

2.1肺组织形态描述法〔3～5〕

2.1.1对肺泡的描述 肺泡的描述主要涉及肺泡大小是否均匀、结构是否完整、有无萎陷，肺泡间隔厚度、断裂融合及水肿情况，肺泡腔内及肺泡壁炎症细胞浸润情况，肺泡腔内有无渗出液、红细胞和含有含铁血黄素颗粒的巨噬细胞等。

2.1.2对支气管的描述 支气管的描述主要涉及支气管管壁细胞、纤毛等排列是否整齐、有无断裂，支气管黏膜上皮的脱落情况、上皮细胞有无肿胀，黏膜皱襞是否增多，杯状细胞、黏膜下腺体、平滑肌、结缔组织的增生情况，支气管壁、上皮下基底膜的厚度，管壁周围是否有淋巴滤泡的形成，管腔内外炎症细胞浸润情况，腔内分泌物情况等。

2.1.3对肺间质的描述 对肺间质的描述主要涉及肺血管周围及腔内炎症细胞浸润情况，血管壁厚度、充血、淤血、出血情况，血管是否扩张；肺间质组织成纤维细胞增生及胶原纤维增生情况、间质内充血、出血、水肿及炎症细胞浸润情况等。

2.2肺组织病理评分

2.2.1肺组织损伤程度 Wang等〔6〕将肺组织病理损伤分为3个级别：轻度：肺组织及各种小支气管炎症细胞浸润占全视野的1/3以下，肺泡融合占全视野1/3以下；中度：肺组织及各种小支气管炎症细胞浸润占全视野的2/3以下，肺泡融合占全视野2/3以下；重度：肺组织及各种小支气管炎症细胞浸润占全视野的2/3以上，肺泡融合占全视野2/3以上。

2.2.2气道炎症评分〔7〕选取直径≤1 100 μm(管腔最短径/最长径≥0.7)的膜性细支气管，观察以下7项指标：①上皮脱落糜烂；②上皮杯状细胞增生；③管壁中性粒细胞(PMN)浸润；④管壁淋巴细胞浸润，淋巴滤泡形成；⑤管壁单核-巨噬细胞浸润；⑥管壁嗜酸粒细胞浸润；⑦管腔渗出。对各组大鼠按上述7项指标分别评分，无病变者为0分，将轻、中、重度异常分别评为1、2、3分，然后累加每一指标得分，将累加分占该标本内所有被检的细支气管可能得到的最高分的百分数，作为该标本细支气管这一指标的病理积分，把7项指标的病理积分相加，即可得到每一标本细支气管的病理得分。

2.2.3气道黏液分泌评分 马文娴等〔8〕采用5分(0～4)评分系统评价气道上皮细胞中PAS染色阳性细胞百分比：无杯状细胞为0分；杯状细胞<25%为1分；杯状细胞25%～50%为2分；杯状细胞51%～75%为3分；杯状细胞>75%为4分。

2.3肺组织的定量分析

2.3.1肺泡损伤程度 肺泡结构异常和肺气肿是COPD的主要病理生理改变，是气流受限的主要因素〔9〕。有研究通过肺泡直径(μm)〔10〕和肺泡平均横断面积(μm2)〔11〕反映肺泡损伤程度。肺泡平均截距(MLI)、单位面积平均肺泡数(MAN)和平均肺泡面积(MAA)是反映肺泡结构变化及肺气肿程度的常用指标〔12，13〕。每组取6张及以上切片，每张切片在光镜下随机选取6个视野，在100/200倍镜下避开支气管和大、中血管截取图片，以计算肺泡大小和密度。

MLI(μm)=L/Ns：在每张切片中间画“十”，测量其长度(L)，计数经过此“十”字线的肺泡隔膜数(Ns)，其反映视野内平均肺泡的直径。

MAN(/mm2)=Na/S：计算每个视野的肺泡数(Na)，测量每个视野的面积(S)，其反映视野内单位面积肺泡数目。

MAA=(S-P)/Na：计算每个视野的肺泡数(Na)，测量S，再测出HE染色阳性区域(肺实质)面积(P)，其反映视野内平均肺泡面积大小。

2.3.2气道重塑程度 气道重塑是以气道炎症引起气道壁损伤和分子结构发生功能性改变为特点，气道壁增厚、杯状细胞增生、黏液腺肥大等导致的不可逆性气道阻塞是COPD的主要特征〔14〕。肺内支气管分级较多，定量时需选取同等级别支气管，需限定支气管直径或周长。支气管壁厚度(BWT)是反映气道重塑的主要指标，Sun等〔15〕选取周长<100 μm的支气管，测量BWT及支气管直径(D)，计算BWT/D，发现CSE暴露16 w的大鼠BWT/D显著增高。Xu等〔16〕每张随机选取3个直径为200 μm的支气管，用医学图像定量分析(MIQAS)软件进行测量，支气管平滑肌面积(WAsm)=平滑肌层外侧面积(Asmo)-平滑肌层内侧面积(Asmi)，用管壁周长(Pi)进行标准化，单位长度平滑肌层面积(WAsm/Pi，μm2/μm)表示平滑肌层厚度。王红岗等〔17〕采用 Image-Pro Plus 图像分析软件测量各组大鼠细BWT(μm)、管壁面积(WA，μm2)、WA/腔周长(μm2/μm)。谭玉萍等〔18〕选取膜性细支气管(直径750～1 100 μm)，测量各组大鼠管壁厚度(WT)、管壁平滑肌厚度并计算比值，测量WA、管腔面积(LA)并计算比值以反映气道重塑程度。

2.3.3血管重构程度 肺血管重构是COPD的主要病理特征，是诱发肺动脉高压的根源〔19〕。何飞等〔20〕研究药物对COPD大鼠肺血管重构的影响，HE染色后光学显微镜下观察肺小动脉形态学改变，利用病理图文分析系统采集图像，测量与终末细支气管伴行的肺小动脉WT、血管直径(VD)、LA、血管总面积(TA)、WA，然后计算WT占血管外径百分比(WT%)、WA占血管总面积百分比(WA%)、LA占TA百分比(LA%)，以此作为大鼠的肺血管形态计量学指标对血管重构程度进行分析。杨宏宽等〔21〕200倍视野下测量细支气管伴行的小动脉的腔面积和总面积及周长，以WT%和WA%评价肺血管重构程度。谭玉萍等〔18〕选取腺泡内肺动脉(直径<400 μm)，测量血管平滑肌厚度、血管壁厚度并计算比值，测量血管壁面积、血管面积并计算比值，检测血管平滑肌增殖情况评价肺血管重塑。Xing等〔22〕选择外径在100～200 μm范围内的小肺动脉进行定量分析。采用BI-2000医学图像分析系统，对每个样本5条动脉的WA和TA进行测量和记录，WA%来评估血管重构。Zeng等〔23〕选取仅限于肺泡管附近的小动脉(直径≤50 μm)，测量肺WT，以外径的百分比表示〔(外径-内径)/外径×100%〕，至少测量10条血管以获得每只动物的平均值。

2.3.4胶原沉积程度 杨宏宽等〔21〕同时也评价了支气管胶原沉积的程度。Masson染色肺组织切片，在100倍光镜下测量气道壁胶原面积(WAc)和气道基底膜周长(Pbm)，胶原沉积的程度用小气道基底膜单位长度的胶原面积(WAc/Pbm)评价。李小龙等〔24〕每张切片选取 3 个视野，采用 Image-ProPlus 测量胶原面积、整个图像总面积，计算胶原面积比(%)=(胶原面积/整个图像总面积)×100%，以此评价肺组织胶原沉积的程度。

2.3.5黏液分泌程度 白学敏等〔25〕进行AB-PAS 染色后采用IPP 软件计数每个切片上的阳性杯状细胞和总上皮细胞数，以阳性杯状细胞/总上皮细胞数比例作为最终参考数据。Feng等〔26〕采用IPP6.0软件计算AB/PAS阳性染色面积与相关支气管上皮总面积的比率以评价支气管上皮细胞杯状细胞化生程度。

综上所述，COPD病理评价方法主要有描述法、评分法、定量法，3种方法各有优势，可综合应用，其中定量法更为客观准确，主要针对肺泡、支气管及小血管形态等进行定量分析，虽然定量分析方法已有较多参考，但实验过程中仍需根据具体实验选取合适的分析方法或者进行改进。例如，在支气管测量时，有些切片难以找到规定范围的支气管，就需要根据实际情况再设定范围，课题组在实验〔27〕过程中发现支气管或小血管WT并不均匀，就选取了3个位置(最长、最短、中间)进行内外径的测量，最后求其平均值，也是在现有报道上的改进。本文根据文献报道结合前期研究经验，对COPD肺组织病理分析的应用进行了举例，并且发现这些分析方法能够较好反映COPD肺泡、支气管及小血管形态结构的病理变化。COPD肺组织病理分析方法的应用或进一步改进可为COPD的基础研究及药物疗效机制的研究提供较为直观的依据，但仍需探索和改进。