支链氨基酸对乳成分合成的影响

2023-04-15郝怡泓李大彪

动物营养学报 2023年2期

郝怡泓李大彪

(内蒙古农业大学动物科学学院，动物营养与饲料科学自治区高等学校重点实验室，呼和浩特010018)

在乳的合成过程中，乳腺倾向于摄取过量的支链氨基酸(branched chain amino acids，BCAA)，这是因为在乳腺上皮细胞中，BCAA的碳骨架可以通过支链α-酮酸脱氢酶部分氧化，为高度活跃的代谢过程提供能量，包括营养物质的运输、蛋白质的周转以及脂质和乳糖的合成，BCAA不仅是细胞生长和乳蛋白合成的原料，还能作为细胞因子，对乳蛋白的合成起调控作用。本文综述了BCAA对乳糖、乳脂以及乳蛋白合成的影响及氨基酸信号转导相关通路，旨在为探明BCAA对乳成分合成的影响。

1 BCAA生物学功能

亮氨酸(leucine，Leu)、异亮氨酸(isoleucine，Ile)和缬氨酸(valine，Val)是动物体内不能合成的必需氨基酸(essential amino acid，EAA)，因其分子组成中碳链都有分支，又被称为BCAA，属于功能性氨基酸[1]。其主要氧化部位在肌肉中，占哺乳动物肌肉组织中EAA总量的40%，占牛奶蛋白中EAA的50%[2]，对奶牛乳蛋白合成非常重要，具有提高乳蛋白合成率和降低乳蛋白降解的作用[3]，此外，BCAA还可以促进胰岛素释放以及调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路[4]。由于其分解产物不同，Val、Leu、Ile分别属于生糖氨基酸、生酮氨基酸和生糖兼生酮氨基酸，虽然BCAA参与乳蛋白的合成和分解，并参与体内的代谢，但与其他EAA不同的是，BCAA不能在肝脏中代谢，而是依赖支链氨基酸转移酶(branched amino acid transferase，BCAT)和支链氨基酸脱氢复合体(branched amino acid dehydrogenation complex，BCKAD)的作用下脱去氨基生成相应的α-酮酸，氧化脱羧生成相应的脂酰辅酶A(CoA)，经过β-氧化生成相应的烯脂酰CoA，自此，三者各自进行分解，生成生糖或生酮产物，最终进入三羧酸循环(TCA循环)生糖或生酮，参与机体氧化供能[5]。

1.1 调控机体乳糖代谢

在反刍动物中，葡萄糖是合成乳糖的主要前体物。哺乳高峰期，血液中60%～85%的葡萄糖被引导到乳腺，以满足牛奶中对葡萄糖生产乳糖的需求[6]。乳腺摄取葡萄糖的过程以及有关乳糖酶活性对乳糖产量有极大影响，能够影响牛奶中乳糖含量[7]。

目前的研究关于BCAA对乳糖代谢的影响有不同的意见。一部分研究表明，增加BCAA添加量能够促进乳糖合成。黄红英[8]试验表明，随着BCAA含量的升高，母猪血液葡萄糖含量呈线性增加趋势，表明BCAA可以促进合成糖原，使得母猪体内血液葡萄糖含量升高，乳腺摄取血液中葡萄糖合成乳蛋白的量增多。Doi等[4]研究指出，BCAA中Leu和Ile均能促进大鼠血浆中葡萄糖代谢，且Ile效果明显优于Leu。Nichols等[9]及Yoder等[10]研究发现，静脉输注Leu和Ile的乳糖产量增加，表明Ile对乳糖合成有积极影响，或者Leu和Ile共同作用时，二者对乳糖合成有积极影响。

然而还有部分研究表示，BCAA的缺失能够促进乳糖的合成。Xiao等[11]研究表明，与正常小鼠相比，饮食中缺乏Leu的小鼠组织中胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和蛋白激酶B(protein kinase，PKB或AKT)的磷酸化增加。Appuhamy等[12]观察到，向不含EAA的培养基中添加40%的BCAA时，奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)中的ATP浓度下降了36%。Curtis等[13]研究表明，所有3种BCAA的颈部输液并没有改变泌乳牛对葡萄糖的净摄取或乳糖产量。

1.2 调控乳脂肪合成

乳蛋白与乳脂肪合成可通过mTORC1-S6蛋白激酶1(protein S6 kinase 1，S6K1)途径相互作用，固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein 1，SREBP 1)被磷酸化的S6K1激活，进而调节乳脂肪的合成。Jenkins等[14]研究表明，一定比例的氨基酸能够促进SREBP1的表达。王立娜[15]研究表明，Leu不仅对乳蛋白合成具有积极的影响，还能上调BMECs内乳脂合成相关基因SREBP1表达和增加甘油三酯(triglyceride，TG)的合成。此外，赵艳丽[16]研究发现，适宜的Leu含量能够激活mTOR信号通路，上调转录因子SREBP1和过氧化物酶体增殖物γ(peroxisome proliferator activated receptor-gamma，PPARγ)的表达，激活酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/信号传导及转录激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)通路上调SREBP1的转录和翻译水平，进而促进了短链和中链脂肪酸(short and medium chain fatty acids，SMCFA)的合成，抑制长链脂肪酸(long chain fatty acids，LCFA)的摄取与转运，乳脂肪合成量增加。此外，Ile和Val对乳脂肪的合成也具有调控作用。李珊珊[17]向BMECs中添加108 μg/mL的Val时，SREBP1基因表达水平增加，表明较低的Val含量能够刺激细胞，通过增加乳脂肪合成基因的表达，诱导乳脂肪的合成。高学军等[18]研究发现，提高BMECs中Ile含量能增加SREBP1c蛋白表达水平，促进乳脂肪的合成。

1.3 调控乳蛋白合成

BCAA作为第2限制性氨基酸，对乳蛋白的合成具有重要意义。Moshel等[19]扣除牛乳腺上皮细胞中几种氨基酸发现，培养基中不含Leu的组，mTOR磷酸化水平、真核细胞起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1)和真核翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)的含量显著降低，与正常氨基酸含量组相比乳蛋白合成量降低。Appuhamy等[20]和Arriola等[21]研究证明，Ile在体外刺激乳腺mTORC1时几乎与Leu一样有效，Ile对mTOR磷酸化有显著影响，且Leu和Ile与核糖体蛋白S6(ribosomal protein S6，RPS6)的磷酸化呈线性关系。Doelman等[22]研究发现，从EAA中扣除可代谢Leu可显著降低乳蛋白含量。董贤文[23]研究表明，提高细胞中Ile和Val含量，能促进BMECs中正向调控酪蛋白合成通路的活性，提高mTOR和RPS6的磷酸化水平，促进酪蛋白合成。

Weekes等[24]对低蛋白质水平饲粮饲喂的奶牛进行研究，发现与真胃灌注总氨基酸组相比，灌注单一缺乏3种BCAA对奶牛乳产量和乳成分没有影响。Appuhamy等[25]研究表明，当蛋氨酸和赖氨酸不限制乳蛋白合成时，BCAA的注入并不能增加乳蛋白的合成。Haque等[26]通过真胃灌注试验发现，降低灌注液中Ile的供给量，使血液中Ile含量下降34%时，对乳蛋白合成无显著影响。徐小宇[27]研究发现，提高Leu含量伴随着Ile、Val等氨基酸含量的降低，但乳蛋白合成量有上升的趋势。

2 BCAA调控乳成分合成的作用机理

2.1 调控乳糖合成的作用机理

在乳腺上皮细胞中，BCAA含量降低倾向于刺激细胞膜上的糖基化和葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1，GLUT1)的表达对乳糖合成速率进行调控。Silva等[28]研究发现，减少对乳腺组织的BCAA供应会增强GLUT1和己糖激酶(hexokinase，HK)的表达，促进葡萄糖摄取和利用，但不影响乳糖合成率。这与细胞外BCAA缺乏与GLUT1的膜靶向性增加、GLUT1的N-糖基化和BMECs中葡萄糖摄取有关[29]。N-糖基化是GLUT1的一种重要的翻译后修饰，它增强了从胞浆到细胞膜的转运、稳定性和对葡萄糖的亲和力[30]。在BMECs中，BCAA缺乏通过促进糖基化增加GLUT1在细胞膜中的表达，从而使GLUT1从胞浆转位到细胞膜，虽然GLUT1到细胞膜的转位不依赖于胰岛素，但它的转录被发现是通过乳腺上皮细胞和乳腺组织中AKT和mTOR介导的细胞信号而被胰岛素增强的[31]。此外，在高尔基体中催化乳糖合成的β-1，4-半乳糖基转移酶的表达因BCAA缺乏而降低，表明BCAA对乳糖合成途径上、下游相关酶的丰度的影响是相反的。也有部分研究表明乳糖合成量增加是因为哺乳动物细胞中的一般性调控阻遏蛋白激酶2(general control nonrepressed 2，GCN2)/转录激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)能够感知到氨基酸缺乏[10]，激活GCN2抑制mTORC1/S6K1信号通路，或是激活AMP活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)信号通路，促进胰岛素信号通路开放，使胰岛素敏感性发生变化[32]，导致乳腺对于血液中葡萄糖吸收利用效率增加。

此外，单独添加BCAA对奶牛乳糖合成有相反的影响。王立娜[15]研究表明，提高BMECs中Leu的添加量能使AKT和GLUT1的基因表达水平显著升高，乳糖含量增加；提高Ile和Val的添加量，乳糖含量无明显变化。十二指肠注入Leu会减少乳糖产量[33]，而皱胃或颈静脉注入Ile往往会增加乳糖产量。其可能的原因是当血液中葡萄糖含量丰富时，细胞膜转运系统通透性受到胰岛素调节发生改变，使得细胞对氨基酸和葡萄糖等营养物质摄取量增加，最终调控机体糖代谢[11]，导致蛋白质和糖原的合成增加。

2.2 调控乳脂肪合成的作用机理

mTOR是乳腺泌乳信号通路中重要的核心成员，对乳蛋白和乳脂肪合成具有显著促进作用[34]。前人研究表明，AKT可能以多种方式针对SREBP，包括使其蛋白体降解途径失活，促进SREBP前体从内质网向高尔基体运输，并促进mTOR的活性[35]。Che等[36]研究发现，Val能激活AKT/mTOR途径，促进SREBP1从细胞质到细胞核的转运，上调SREBP1c介导的猪乳腺上皮细胞(porcine mammary epithelial cells，PMECs)中脂肪合成酶的表达，增加脂肪生成酶的蛋白表达，促进乳脂肪的合成。添加磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K)抑制剂LY294002后，Val对细胞TG含量的影响显著下降，AKT和mTOR的磷酸化程度降低，SREBP1的靶基因乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FASN)和脂肪酸激活与细胞内转运蛋白3(fatty acid activation and intracellular transport 3，FABP3)基因表达水平显著降低。孟春雨等[37]研究结果显示，添加Leu显著促进乳脂的分泌。BCAA能通过氨基酸转运体钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(sodium-dependent neutral amino acid transporter 2，SNAT2)诱导激活mTOR，促进S6K1磷酸化[38]，也可通过PI3K及细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)等调控mTOR通路，调控乳脂肪合成。

2.3 调控乳蛋白合成的作用机理

2.3.1 mTOR信号通路

BCAA刺激乳腺上皮细胞蛋白质合成的机制可能与mTOR激活mRNA翻译启动有关。mTOR与S6K1磷酸化呈正相关，与4EBP1磷酸化呈负相关，4EBP1的磷酸化可以通过促进elF4F复合体的形成来促进翻译启动，而elF4F复合体又将43S预启动复合体招募到大多数mRNAs的5’端。被磷酸化的4EBP1与eIF4E疏远，翻译起始正常形成[39]，从而对蛋白质的起始和翻译进行调控。扣除BMECs中Leu后，mTOR、4EBP1和eIF4E的磷酸化比率降低，乳蛋白合成量减少[19]。Ile或Leu增加Mac-T细胞和牛乳腺组织切片中S6K1的磷酸化，使mTOR活化，促进酪蛋白的合成[20]。

当Leu刺激G蛋白偶联受体信号后，PI3K的p85亚基被募集到临近质膜的位置，p110亚基通过与p85亚基结合将底物磷酸化[40]，与AKT的受体结合物激活后，使PI3K活化，激活AKT，直接将mTOR磷酸化，或通过结节性硬化症复合体(tuberous sclerosis complex，TSC)1/TSC2-Rheb调节mTOR信号[35]，影响基因和蛋白表达。庞学燕等[41]向BMECs中添加mTOR抑制剂LY294002后发现，添加抑制剂能显著抑制Leu对κ-酪蛋白(CSN3)基因和蛋白表达的促进作用，且mTOR、S6K1、eIF4E、eEF2基因表达水平降低。

2.3.2 GCN2信号通路

通常哺乳动物细胞中的GCN2/ATF4用来感知氨基酸限制或氨基酸失衡[42]。当BCAA或Leu缺失导致tRNA空载时，GCN2与未带电的tRNAs结合而被激活[43]。激活的GCN2引起自噬基因的转录，对体内剩余氨基酸进行循环利用，使氨基酸总量得到维持[35]。此外，eIF2α将GCN2激活并反过来使eIF2a磷酸化[44]，由于磷酸化的eIF2α抑制eIF2B和相应的功能eIF2复合体的减少，使翻译启动重新发生在ATF4编码区，ATF4蛋白的合成选择性地增加，ATF4与异源二聚体结合，通过CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer-binding protein，C/EBP)激活转录因子应答元件(C/EBP activating transcription factor response elements,CARE)，调节一系列涉及氨基酸转运、新陈代谢、氧化状态和能量管理的基因，使细胞内氨基酸缺乏得到缓解[43]。Doelman等[22]研究发现，与全部EAA相比，减去BCAA或Leu可降低乳蛋白产量。Edick等[45]研究表明，在离体培养牛乳腺上皮细胞时，精氨酸、Leu和赖氨酸同时缺失时，能激活细胞GCN2信号通路，使S6K1磷酸化水平降低，进而导致BMECs中酪蛋白合成量降低。然而，目前的研究多集中在BCAA通过GCN2信号通路影响肌肉和肝脏中蛋白质及脂肪的合成，BCAA如何通过GCN2信号通路影响BMECs中乳成分的合成仍有待于进一步的研究和探讨。

3 BCAA的拮抗作用对乳成分合成的影响

据文献报道，Harper等在1954年首次发现Ile能消除Leu过量所导致大鼠生长迟缓和采食量下降[46]，由此推测BCAA之间可能存在相互作用。Allen[47]研究发现，BCAA尤其是Leu会损害另一种BCAA的利用，并导致禽采食量和生长减少。Maynard等[48]观察到禽饲粮BCAA之间存在明显的相互作用。Cemin等[49]研究表示，饲喂高Leu水平饲粮可降低血浆和其他几种组织中Ile和Val的含量，影响仔猪采食量。刘财礼等[50]、冉学光等[51]研究表明，适量的Leu能促进仿刺参幼参、中国花鲈等水产动物的生长，但过量添加Leu会加速蛋白质的合成作用，引起Ile和Val缺乏，影响机体生长。

现有研究表明，BCAA的相互作用主要表现为BCAA拮抗，由于三者间相似的化学结构，使得他们的拮抗主要表现为：1)运载体的竞争由于BCAA结构相似，在通过各种膜被动物体消化吸收时，彼此之间竞争运载系统。2)酶活性的竞争，作为组成蛋白质的EAA，蛋白质及组织中的BCAA含量较为稳定。当BCAA在动物体内的含量发生改变时，通过降低BCAA的tRNA连接酶活性，使BCAA参与蛋白质的合成过程受阻。3)相同酶的催化竞争，BCAA的转氨和脱氢作用都是由BCAT和α-酮酸脱氢酶催化的，因此，同一生化反应将会引起BCAA同时进行分解代谢，这时3种BCAA为竞争相同分解反应的酶而表现出强烈的拮抗作用[52]。

对BMECs的研究也发现了BCAA的这种相互作用。Haque等[26]观察到去除EAA中的Val时，总的BCAA含量下降至28%，乳蛋白合成量降低。推测BCAA之间存在一种平衡状态，某种BCAA过量或不足可能会使乳腺对其他2种BCAA的摄取和利用造成影响。这与徐小宇[27]的研究结果一致，其给泌乳山羊颈静脉梯度灌注Leu，发现当Leu部分或全部缺失时，Ile和Val含量上升，乳蛋白产率降低。相当于创造了高Ile、Val含量、低Leu含量的条件，即BCAA不平衡，故推测BCAA之间存在拮抗或交互作用能够影响乳蛋白的合成。赵素曼[53]在BMECs上的研究验证了这一猜想，尽管Leu、Ile的缺失对BMECs细胞增殖没有影响，但对蛋白信号通路的一些mRNA表达量及蛋白磷酸化程度产生影响，证明BCAA之间确实存在相互作用，影响乳中蛋白质的合成和分解。但目前关于BCAA的研究多集中在单胃动物和水产动物上，其在BMECs上的研究较少，对乳成分的影响及其作用机制相关研究仍不清楚，有待于进一步的研究和探索。