有关“筛选”的问题归类分析

曹建平

(江苏省南通市海安市曲塘中学)

高中生物学育种、基因工程、细胞工程、发酵工程等教学内容中都涉及“筛选”问题,高考题和模拟题也常以其作为命题素材,本文对“筛选”问题简要归纳并结合例题进行分析。

一、育种中的筛选

为获得所需要的生物类型,在杂交育种、诱变育种、单倍体育种等过程中都要进行筛选。在杂交育种过程中,为选育出符合要求的显性纯合子,可让具有显性性状的个体连续自交,直到不再发生性状分离为止。

【例题1】(2014年江苏卷,T13)图1是高产糖化酶菌株的育种过程,有关叙述错误的是

( )

图1

A.通过图1筛选过程获得的高产菌株未必能作为生产菌株

B.X射线处理既可以引起基因突变也可能导致染色体变异

C.图1筛选高产菌株的过程是定向选择过程

D.每轮诱变相关基因的突变率都会明显提高

【解析】由于X射线处理导致的基因突变具有随机性,所以筛选获得的高产菌株也可能存在其他的基因突变而不能作为生产菌株,选项A正确;X射线处理可以引起基因突变,也可能造成染色体结构变异,选项B正确;题图1是高产糖化酶菌株的育种过程,是定向筛选高产菌株的过程,选项C正确;因为基因突变的随机性、低频性以及不定向性,所以不是每轮诱变相关基因的突变率都会明显提高,选项D错误。

【答案】D

【例题2】(2018年江苏卷,T8)花药离体培养是重要的育种手段。图2是某二倍体植物花药育种过程的示意图,下列叙述正确的是

( )

图2

A.为了防止微生物污染,过程①所用的花药需在70%乙醇中浸泡30 min

B.过程②的培养基中需添加较高浓度的细胞分裂素以利于根的分化

C.过程③逐步分化的植株中可筛选获得纯合的二倍体

D.过程④应将炼苗后的植株移栽到含有蔗糖和多种植物激素的基质上

【解析】为了防止微生物污染,培养所用的花药(外植体)需在70%乙醇中浸泡30 s,立即用无菌水清洗2～3次。在70%的乙醇中浸泡30 min,细胞会死亡,选项A错误;过程②是脱分化,培养基中应加入比例适中的生长素和细胞分裂素以达到脱分化的效果,选项B错误;由于用秋水仙素可以诱导细胞中染色体数加倍,所以过程③逐步分化的植株中可筛选获得纯合的二倍体,选项C正确;炼苗的目的是使幼苗适应外界的环境。炼苗后,应洗去根部富含有机物的培养基,栽种到以无机营养为主的普通基质上,选项D错误。

【答案】C

二、微生物的筛选

自然界中微生物种类庞杂,有时候人们会发现一些特殊功能的微生物,为了将该类微生物分离出来并使用,就需要对其进行筛选。借助选择培养基,依据不同类型微生物的特性,通过改变培养基的成分等来实现筛选出人类需要的某种微生物。

【例题3】(2014年全国新课标卷Ⅰ,T39,节选)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题:

(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落,某同学设计了甲、乙两种培养基(成分如表):

酵母膏无机盐淀粉纤维素粉琼脂CR溶液水培养基甲++++-++培养基乙+++-+++

据表判断,培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌,原因是________;培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌,原因是________。

【解析】(3)培养基甲中未添加琼脂,为液体培养基,液体培养基上不能形成单菌落,故不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。培养基乙中未添加纤维素粉,不能和CR溶液形成红色复合物,即使出现单菌落也不能确定为纤维素分解菌。

【答案】(3)不能 液体培养基不能用于分离单菌落 不能 培养基中没有纤维素,不会形成CR-纤维素红色复合物,即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌

三、细胞工程中的筛选

(一)植物体细胞杂交技术中的筛选

植物体细胞杂交技术中涉及原生质体的融合过程,在融合细胞中有同种和异种融合两种类型,因此涉及对杂种细胞的筛选。

【例题4】(改编)实验人员利用矮牵牛(二倍体,2n=14)的红色花瓣细胞(液泡呈红色)与枸杞(四倍体,4n=48)叶肉细胞,制备相应的原生质体并诱导其融合,经筛选、培养获得杂种植株。下列有关叙述正确的是

( )

A.酶解法制备原生质体的主要原理是酶的高效性

B.原生质体培养在无菌水中可以避免杂菌污染

C.若原生质体两两融合,融合细胞染色体数均为62条

D.可利用光学显微镜观察,筛选出杂种细胞

【解析】诱导植物细胞融合前,先去除细胞壁,获得原生质体。因为植物细胞的细胞壁主要成分是纤维素和果胶,所以用纤维素酶和果胶酶处理,这里依据的是酶的专一性,选项A错误;原生质体没有细胞壁,培养在低浓度溶液(无菌水)中会吸水涨破,应该在等渗溶液中培养,选项B错误;若原生质体两两融合,会形成3种细胞,即矮牵牛细胞自身融合的细胞、枸杞细胞自身融合的细胞以及杂种细胞,故融合细胞中染色体数目可能为28条、96条、62条,选项C错误;因为杂种细胞中既含有绿色的叶绿体(叶肉细胞含叶绿体),也含有红色的液泡,所以可以用光学显微镜观察细胞的颜色进而筛选出杂种细胞,选项D正确。

【答案】D

(二)单克隆抗体制备中的筛选

在单克隆抗体制备过程中,经诱导融合剂处理后的细胞需要进行两次筛选。首先,B淋巴细胞与骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒或聚乙二醇(PEG)等方法的诱导下融合后,混合物中有多种类型的细胞,包括未融合的B淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞、两个B淋巴细胞融合形成的融合细胞、两个骨髓瘤细胞融合形成的融合细胞、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞,以及3个(含)以上细胞融合成的融合细胞。其中杂交瘤细胞是制备单克隆抗体所必需的,因此,需要进行第一次筛选,从多种细胞中筛选出杂交瘤细胞。

又因为B淋巴细胞是从动物体内提取的,有的可能是动物体内曾接触过其他抗原刺激而分化产生的,只具有分泌其他抗体的能力;有的并未接受抗原刺激,未分泌抗体;只有一部分B淋巴细胞是接受了实验用的抗原刺激能分化产生浆细胞,能分泌目标抗体。又因为很多抗原具有多个不同的抗原决定簇,所以这些接受了实验抗原刺激的B淋巴细胞分化产生的浆细胞产生的抗体也不是单一的,受该抗原刺激后的每个B淋巴细胞都能产生一种只针对某抗原决定簇的抗体。因此,需要进行第二次筛选,即从众多杂交瘤细胞中筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。

【例题5】(2020年全国卷Ⅰ,T38,节选)为研制抗病毒A的单克隆抗体,某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。

图3

回答下列问题:

(3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞,需要进行筛选。图3中筛选1所采用的培养基属于________,使用该培养基进行细胞培养的结果是____________。图3中筛选2含多次筛选,筛选所依据的基本原理是____________。

【解析】图3中筛选1采用特定的选择培养基,在该培养基上,未融合的细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡,只有融合的杂种细胞(杂交瘤细胞)才能生存。图3中筛选2含多次筛选,利用抗原与抗体特异性结合的原理,就可获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。

【答案】(3)选择培养基 只有杂交瘤细胞能够生存 抗原与抗体的反应具有特异性

【知识拓展】(1)HAT培养基:细胞DNA的合成有两条途径,一条途径是生物合成途径(D途径),由糖和氨基酸合成核苷酸,进而合成DNA,叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是应急途径或补救途径(S途径),在次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)存在的情况下,经次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用下生成相应的核苷酸,然后再合成DNA。

HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。未融合的淋巴细胞和2个B淋巴细胞相互融合形成的融合细胞虽S途径正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右死亡。对骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,通常实验采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型细胞,由于自身没有S途径,且D途径又被氨基喋呤阻断,所以在HAT培养液中不能增殖而很快死亡。只有杂交瘤细胞,既具有B淋巴细胞的S途径,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液能无限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖。

(2)有限稀释法:二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞充分稀释,接种在多孔细胞培养板上,使每孔内细胞不超过一个,通过培养让其增殖,然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体(常用酶联免疫吸附试验法),上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞,继续进行有限稀释,一般重复3～4次,直至确定每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞株。

四、基因工程中的筛选

由于目的基因与载体正确连接效率、重组质粒导入细胞的效率都不是百分之百,导致受体细胞经转化处理后,绝大部分仍是原来的细胞,或者是只含质粒的细胞。为了分离出含目的基因的受体细胞,需要对处理过的大量受体细胞进行筛选和鉴定。

【例题6】(2016年新课标Ⅰ卷,T40,节选)某一质粒载体如图4所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:

(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是________;并且________和________的细胞也是不能区分的,其原因是________。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落,还需使用含有________的固体培养基。

【解析】(2)依题意可知,目的基因插入后,导致四环素抗性基因(Tetr)失活,而氨苄青霉素抗性基因(Ampr)仍能行使正常功能。用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞均不含氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上都不能生长,所以是不能区分的;含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞都含氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上都能生长,也是不能区分的。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有四环素的固体培养基;因目的基因插入后,导致四环素抗性基因(Tetr)失活,含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长,而含有质粒载体的则能正常生长。