二氧化硅通过调节人气道上皮细胞自噬促进MUC5AC表达

王孝芸 唐红梅 王星 马宁 李月蛟 袁谢芳 徐国锋 张沄，2

西南医科大学附属医院1炎症与变态反应实验室，2呼吸与危重症医学科（四川泸州646000）

空气污染是全球面临的严峻问题。大气颗粒物（PM）暴露可导致哮喘等呼吸道疾病的发生［1］。SiO2是PM 的一种，肺炎和肺纤维化与SiO2密切相关。黏液高分泌是气道疾病的病理性特征，黏液蛋白是黏液的主要成分，MUC5AC 是气道分泌最多的一种黏液蛋白［2-5］。SiO2可诱导气道黏液过度表达［6］，但其影响气道黏液高分泌的作用机制还鲜有报道。

自噬是细胞在自噬相关基因的调控下，利用溶酶体降解所包裹内容物的过程，对维持细胞内稳态有重要作用［7］。自噬可通过调控NFKB1 和AP-1 的活性，以及促进JNK 和c-Jun 的磷酸化等途径参与调节PM 暴露诱导的黏液高分泌［8-9］，但自噬是否参与SiO2诱导的气道黏液高分泌鲜见报道。本研究旨在探讨SiO2是否通过自噬增加人气道上皮细胞中MUC5AC 的表达。

1 材料与方法

1.1 主要材料人气道上皮细胞株Beas-2b（ATCC）；高糖DMEM 培养基（Hyclone）；mCherry-EGFP-LC3慢病毒载体、ATG5-siRNA 和BECN1-siRNA 慢病毒载体（中国上海吉凯生物技术公司）；SiO2（大连美仑生物技术有限公司）；用于Western blot 的抗体：MUC5AC（Abcam）、ATG5（MBL 公司）、BECN1（MBL公司）、LC3Ⅱ（Abcam）、GAPDH（碧云天生物技术）。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基在37 ℃和5% CO2的培养箱培养Beas-2b。将Beas-2b分为对照组、SiO2组、NC-siRNA 组、NC-siRNA+ SiO2组、ATG5-siRNA 组、ATG5-siRNA+ SiO2组、BECN1-siRNA 组、BECN1-siRNA+SiO2组。各转染组细胞用相应慢病毒（MOI = 20）转染12 h 后换新鲜培养基，并用1 μg/mL 的嘌呤霉素进行筛选，获得稳定转染细胞株。细胞用100 μg/mL 的SiO2刺激24 h。

1.2.2 免疫荧光检测Beas-2b 中MUC5AC 的表达将Beas-2b 细胞接种在共聚焦培养皿用于免疫荧光分析。4%多聚甲醛室温固定细胞15 min，PBS 清洗后用0.1%的TritonX-100 穿孔10 min，然后用1% BSA 室温封闭30 min。封闭后用抗MUC5AC的一抗（1∶50）4 ℃孵育过夜。次日加入Alexa Fluor 555 结合的二抗（1∶100）室温避光孵育1 h，然后加入DAPI 室温避光作用5 min。所有步骤完成后将标本置于激光共聚焦显微镜下观察MUC5AC表达并进行分析。

1.2.3 共聚焦显微镜观察Beas-2b 自噬情况将Beas-2b 细胞接种在共聚焦培养皿培养，用mCherry-EGFP-LC3 慢病毒（MOI=20）转染细胞，100 μg/mL的SiO2刺激细胞24 h。24 h 后在共聚焦显微镜下观察Beas-2b 自噬情况。

1.2.4 Western blot 检测Beas-2b 中MUC5AC、ATG5、BECN1 和LC3 蛋白表达用RIPA 裂解液（已加磷酸酶抑制剂）于冰上裂解细胞5 min，在4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，取上清液即为蛋白提取液。BCA 法测定蛋白浓度。用12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离蛋白（恒压100 V，90 min），三明治法将蛋白转移至PVDF 膜（恒流200 mA，3 h），5%脱脂奶粉室温封闭2 h。封闭后分别用MUC5AC 抗体（1∶500）、LC3B 抗体（1∶1 000）、BECN1 抗体（1∶1 000）和ATG5 抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。次日加入相应的二抗于室温孵育2 h。TBST 洗涤后用凝胶成像仪采集条带图像，并用FluorChem 8900 软件分析目的蛋白条带吸光度值。

1.3 统计学方法应用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，所有数据用（）表示，并进行正态性检验和方差齐性检验，组间比较采用t检验和单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 SiO2 增加Beas-2b 细胞MUC5AC表达SiO2组的MUC5AC 荧光强度高于对照组（P＜0.01，图1A、B）。SiO2组的MUC5AC表达高于对照组（P＜0.05，图1C、D）。

图1 SiO2增加Beas-2b 中MUC5AC表达Fig.1 SiO2 increased the expression of MUC5AC in Beas-2b

2.2 SiO2 促进Beas-2b 自噬蛋白表达SiO2组的自噬小体较对照组有明显增加（图2A、B）。SiO2组的ATG5、BECN1 和LC3Ⅱ的蛋白水平要高于对照组（P＜0.05，图2C、D）。

图2 SiO2促进Beas-2b 自噬蛋白表达Fig.2 SiO2 promoted the expression of autophagy protein in Beas-2b

2.3 SiO2通过上调ATG5增加Beas-2b中MUC5AC表达SiO2可使Beas-2b中MUC5AC、LC3Ⅱ和ATG5的蛋白水平增加（P＜0.05），而ATG5-siRNA 转染细胞后，以上蛋白的表达均减少（P＜0.05，图3A、B）。ATG5 被敲减后，SiO2诱导的MUC5AC表达降低（P＜0.05，图3C、D）。

图3 SiO2通过上调ATG5 增加Beas-2b 中MUC5AC表达Fig.3 SiO2 increased the expression of MUC5AC in Beas-2b by up-regulating ATG5

2.4 SiO2通过上调BECN1增加Beas-2b中MUC5AC表达BECN1 敲减的Beas-2b 被SiO2刺激后，LC3Ⅱ和MUC5AC 蛋白水平均低于阴性对照细胞（P＜0.05，图4）。

图4 SiO2通过上调BECN1 增加Beas-2b 中MUC5AC 的表达Fig.4 SiO2 enhanced the expression of MUC5AC in Beas-2b by up-regulating BECN1

3 讨论

空气污染，尤其是环境中的PM 对人的身体健康有许多不利影响，而肺则是被其主要影响的器官。研究表明，长期暴露于PM 污染会导致肺功能降低，并加重哮喘等慢性呼吸系统疾病［10-12］。SiO2是大气颗粒物的一种，容易引起严重的肺损伤、矽肺病或特异性肺纤维化［13-15］。

黏液高分泌是气道疾病的重要病理特征，MUC5AC 是气道分泌最多的一种黏液蛋白。炎性因子、空气污染物和病原体均可导致MUC5AC高表达并进一步促进炎症［16-17］。研究表明，SiO2可以诱导黏液过度表达［6］，但其调节Beas-2b 中MUC5AC表达的作用机制目前还鲜报道。本研究用100 μg/mL 的SiO2刺激Beas-2b 细胞24 h，分别用免疫荧光和Western blot 方法检测Beas-2b 细胞中MUC5AC表达，结果发现SiO2刺激组的MUC5AC表达明显高于PBS 对照组，提示SiO2可以促进Beas-2b中MUC5AC 的表达。

自噬是细胞自身的一种程序性死亡，参与多种疾病的发生发展过程。近年研究发现，自噬在包括慢性肺阻塞性疾病、特异性肺纤维化、急性肺损伤及肺癌等呼吸道相关疾病中起着重要作用［18-20］。参与自噬过程的多种自噬相关蛋白如ATG5、BECN1和LC3 及PI3K/AKT/mTOR、AMPK 等多条信号通路均可影响炎性因子的释放和细胞死亡等过程［21］。有研究报道，SiO2可以通过PI3K/AKT/mTOR 信号途径，诱导大鼠肺泡巨噬细胞自噬并产生炎症；SiO2导致的肺纤维化与单核细胞趋化蛋白诱导蛋白1（MCPIP1）/p53 信号途径介导的自噬相关；研究表明SiO2还可激活肺成纤维细胞自噬［22-24］。然而SiO2是否能引起气道上皮细胞自噬并未有研究报道。本研究中，用SiO2刺激Beas-2b，在共聚焦显微镜下观察Beas-2b 中的自噬现象，发现SiO2组的自噬体（mCherry+EGFP+）和自噬溶酶体（mCherry+EGFP-）较对照组均有明显增加。同时用Westernblot 实验检测自噬相关蛋白ATG5、BECN1 和LC3 II 表达，结果显示在SiO2组中此3 种蛋白表达水平均高于对照组。表明，SiO2可促进Beas-2b 细胞自噬。

本研究进一步探讨了SiO2通过调节Beas-2b 细胞自噬并促进MUC5AC表达的作用机制。迄今为止，共有三十多种自噬相关基因和蛋白被证实，BECN1、ATG5 和LC3 是其中被研究最多的分子［7］。BECN1 在自噬泡的形成中起重要作用，可促进胞吞作用和内涵体的成熟。ATG5 可与自噬泡融合，是参与自噬泡延伸的关键蛋白。LC3 同样参与自噬泡的延伸，它能够与新形成的膜结合，直到自噬溶酶体的形成，因此LC3 常被用作自噬形成的标志［25］。本研究分别用ATG5-siRNA 和BECN1-siRNA 转染人气道上皮细胞，同时用NC-siRNA 转染细胞做阴性对照。Western blot 和免疫荧光实验显示，ATG5-siRNA+SiO2组和BECN1-siRNA+SiO2组的LC3Ⅱ水平较NC-siRNA+SiO2组有明显降低，且MUC5AC表达较阴性对照组也有所减少。以上说明SiO2可通过上调ATG5 和BECN1 增加气道上皮细胞自噬，从而促进MUC5AC 的表达。

综上所述，本研究探索了SiO2通过调节人气道上皮细胞自噬促进MUC5AC表达的作用及机制。首次表明，SiO2可通过上调ATG5 和BECN1，增加气道上皮细胞自噬并促进MUC5AC 的表达，为临床治疗相关呼吸道疾病提供了新的思路。但本研究亦存在一些不足，比如只做了细胞实验未做动物实验，以及SiO2对ATG5 和BECN1 的具体调节机制未阐明。后续将跟进动物实验，并对相关自噬调控机制做进一步研究。

【Author contributions】ZHANG Yun：Conceived and designed the study.WANG Xiaoyun，TANG Hongmei，WANG Xing，MA Ning，LI Yuejiao，YUAN Xiefang，XU Guofeng：Performed the experiments.WANG Xiaoyun：Wrote the paper.WANG Xing，WANG Xiaoyun and ZHANG Yun：Analyzed the data.All authors read and approved the final manuscript