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自噬对激素性股骨头坏死大鼠的作用效果分析

2023-04-13屈肖肖乔庆阳陈宁宋同阳李瑜刘树义

实用医学杂志 2023年3期
关键词:脂质股骨头内皮

屈肖肖 乔庆阳 陈宁 宋同阳 李瑜 刘树义

1西安医学院临床医学院(西安710021);2西安医学院第二附属医院耳鼻咽喉科(西安710038)

激素性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head,SANFH)是由于激素长期或过量使用导致股骨头出现骨小梁减少、股骨头塌陷的一种疾病。患者通常以髋部疼痛、髋关节活动障碍为主要临床表现,严重者出现瘫痪[1]。SANFH 多累及双侧股骨头,目前除全髋关节置换术外,尚无有效的治疗方法。行手术治疗后可能面假体松动、使用寿命、假体周围骨折、感染等并发症[2]。因此,探索SANFH 的防治策略是临床亟待解决的难题。目前对SANFH 的研究较为广泛,其中脂质代谢紊乱学说的关注度较高。研究表明,激素可使机体内血脂升高,股骨头内出现脂滴堆积现象,进而出现股骨头坏死[3],而应用他汀类药物可改善高血脂和股骨头坏死发生率[4-5]。但这仍无法满足临床治疗需求,其预防机制和方法仍需进一步探究。本研究通过构建SANFH 大鼠模型,给予自噬干预后观察股骨头坏死、血脂及血管内皮改善情况,为临床寻找防治SANFH 的新方法。

1 材料与方法

1.1 研究材料本研究实验动物SD 大鼠18 只(SPF 级)购自西安交通大学医学部实验动物中心,雌、雄各9 只,平均体质量为(241.37 ± 10.45)g。脂多糖(LPS,货号:L8880)、3-甲基腺嘌呤(3-MA,货号:IM0190)、雷帕霉素(Rapamycin,货号:R8140)购自北京索莱宝科技有限公司;注射用甲泼尼龙琥珀酸钠(40 mg/瓶)购自辉瑞制药有限公司。LC3Ⅱ/Ⅰ(货号:14600-1-AP)、p62(货号:18420-1-AP)抗体购自Proteintech 公司。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、一氧化氮(NO)等ELISA 试剂盒均购自美国R&D 公司。本研究经西安医学院生物医学科学研究伦理委员会批准(伦理审批号:XYLS2022110)。

1.2 研究方法

1.2.1 分组及动物模型制备大鼠进入动物中心后,适应性饲养1 周,采用随机数字表法分为3 组:模型组(M 组)、自噬阻断组(M-3-MA 组)及自噬激动组(M-Rap 组),每组6只,雌、雄各半。3组大鼠经腹腔注射LSP(20 μg/kg)2 次,每次间隔24 h,然后两侧臀肌交替注射甲泼尼龙(40 mg/kg),每周3 次,每次间隔24 h,持续4 周。M-3-MA 组与M-Rap 组每次肌肉注射甲泼尼龙前30 min,经腹腔分别注射3-MA(2.5 mg/kg)、雷帕霉素(1 mg/kg)。停止给予甲泼尼龙后继续饲养4 周,腹主动脉采血、收集双侧股骨头标本。

1.2.2 股骨头坏死表面积测量股骨头坏死表面积测量方法参考赵凤朝等[6]使用的“坐标纸粘贴法”。具体为:将坏死股骨头切成层厚为5 mm 薄片,粘帖于坐标纸上并瞄记其范围,采用Leica 图像分析仪计算实际面积。

1.2.3 血脂测定经腹主动脉采血2 mL 于促凝管中,离心制备血清,采用自动生化仪三联酶法检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。

1.2.4 血清eNOS、NO及内皮素1(ET-1)含量测定采用ELISA 法测定血清中eNOS、NO 及ET-1 含量。按照试剂盒说明书进行样品制备,加入酶标抗体孵育,待反应终止后,采用全自动多功能酶标仪,于波长450 nm 处测定各孔吸光度值(OD值),绘制标准曲线,计算各组大鼠血清eNOS 和ET-1 含量。

1.2.5 Western blot 检测LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 蛋白表达量股骨头组织称重后置于组Ⅰ织研磨机中,将股骨头研磨为匀浆状,加入配置好的组织裂解液后置于冰上裂解,每个5 min 涡旋1 次,30 min 后置于高速离心机离心,吸取取上清液后采用BCA 法进行蛋白定量。配制10%分离胶进行凝胶电泳,100 V恒压湿转90 min。使用5%脱脂奶粉室温下封闭60 min,裁取目的蛋白条带并加入GAPDH(1∶1 000)、LC3Ⅱ/Ⅰ(1∶1 000)及p62(1∶1 000)抗体溶液,4 ℃摇床孵育过夜。第2天用PBST洗膜4次×5 min后加入二抗(1∶20 000,HRP 标记)溶液,室温孵育1 h。PBST 洗涤4 次后,沥干膜表面水分,浸于ECL 化学发光液中,3 min 后将条带铺于胶片夹内,于暗室内进行曝光、显影。应用Image-Pro Plus 软件分析蛋白条带灰度值。

1.3 统计学方法实验数据采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析。计量资料采用()表示,组间比较采用t检验或单因素方差分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠自噬活性评价结果比较与M 组比较,自噬干预后,M-3-MA 组大鼠股骨头组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量降低,而p62 蛋白表达量增加,M-Rap 组LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量增加,而p62 蛋白表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠股骨头组织中LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 蛋白表达情况Fig.1 Protein expression of LC3Ⅱ/Ⅰand p62 in femoral head tissue of rats in each group

2.2 各大组鼠股骨头坏死情况比较3 组大鼠股骨头均发生了坏死,M 组、M-3-MA 及M-Rap 组发生率分别为66.7%(4/6)、100%(6/6)、33.33%(2/6),且各组组内雌、雄鼠之间股骨头坏死率差异无统计学意义(P>0.05)。与M 组比较,M-3-MA 组大鼠股骨头坏死面积更广泛,而M-Rap 组平均股骨头坏死面积更小,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2、表1。

表1 3 组大鼠股骨头坏死表面积比较Tab.1 Comparison of femoral head necrosis surface area among three groups±s

表1 3 组大鼠股骨头坏死表面积比较Tab.1 Comparison of femoral head necrosis surface area among three groups±s

组别M 组(n = 6)M-3-MA 组(n = 6)M-Rap 组(n = 6)F 值P 值股骨头坏死[例(%)]4(66.7)6(100)2(33.3)股骨头坏死表面积(mm2)左(L)1.61 ± 0.17 2.56 ± 0.34 1.06 ± 0.21 17.121 0.001右(R)1.33 ± 0.22 1.98 ± 0.10 1.02 ± 0.10

图2 3 组大鼠股骨头标本Fig.2 Rat femoral head specimens of three groups

2.3 各组大鼠血脂情况比较与M 组相比,自噬干预后M-3-MA 组大鼠血浆中TG、TCH 及LDL 水平升高而HDL 水平下降,M-Rap 组血浆中TG、TCH及LDL 水平下降而HDL 水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3 组大鼠血脂情况比较Tab.2 Blood lipids of rats in three groups were compared ±s,mmol/L

表2 3 组大鼠血脂情况比较Tab.2 Blood lipids of rats in three groups were compared ±s,mmol/L

注:与M 组比较,#P <0.05

组别M 组(n = 6)M-3-MA 组(n = 6)M-Rap 组(n = 6)F 值P 值TG 1.85 ± 0.08 2.47 ± 0.15#1.19 ± 0.14#16.516<0.05 TCH 4.36 ± 0.31 5.29 ± 0.23#3.16 ± 0.10#14.372<0.05 HDL 1.82 ± 0.07 1.03 ± 0.11#2.85 ± 0.12#15.228<0.05 LDL 0.52 ± 0.11 1.98 ± 0.09#0.28 ± 0.08#15.814<0.05

2.4 各组大鼠血浆eNOS、ET-1 含量比较与M组相比,自噬干预后M-3-MA 组大鼠血清eNOS、NO 含量降低而ET-1 升高,M-Rap 组大鼠血清eNOS、NO 含量升高而ET-1 下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3 组大鼠血清eNOS、NO 及ET-1 含量比较Tab.3 Comparison of serum eNOS,NO and ET-1 contents among three groups±s

表3 3 组大鼠血清eNOS、NO 及ET-1 含量比较Tab.3 Comparison of serum eNOS,NO and ET-1 contents among three groups±s

注:与M 组比较,#P <0.05

组别M 组(n = 6)M-3-MA 组(n = 6)M-Rap 组(n = 6)F 值P 值eNOS(U/mL)26.13 ± 3.21 20.32 ± 2.64#35.78 ± 3.13#22.367<0.05 NO(μmol/L)21.38 ± 6.53 14.49 ± 9.62#30.72 ± 6.17#30.536<0.05 ET-1(pg/mL)52.41 ± 6.82 68.92 ± 6.76#38.55 ± 7.56#27.284<0.05

3 讨论

SANFH的发病与代谢、凝血等多重因素有关[7],随着研究深入脂质代谢紊乱成为了SANFH 研究的焦点。研究表明,激素可诱发高脂血症进而使得脂质在全身多个部位出现沉积,部分脂滴会以胞饮的形式进入组织细胞,形成细胞内“占位”效应,在股骨头内引发髓内高压、滋养血管闭塞、静脉回流受阻等变化,最终导致细胞功能受损、死亡[8-9]。在SANFH 动物模型中发现,激素不仅能够削弱成骨细胞的作用,而且能增加股骨头髓内脂肪的生成,而阿托伐他汀类等药物能够改善激素诱发的脂质沉积[10-11]。此外激素进入机体后,可与血液中未乳化的脂蛋白球结合形成脂肪栓子,进而随血液循环堵塞外周血管[12-13],引发组织缺血性坏死。因此,在长期、大量使用激素过程中若给予恰当、有效的机体脂代谢调节措施,理应能降低股骨头坏死的发病率。2009年,SINGH 等[14]首次发现自噬能够调节细胞内脂质储量,揭示了脂质代谢过程中自噬的关键作用,并将这一现象命名为“脂肪噬”(lipophagy)。近年来的研究表明,脂质吞噬作用在许多不同类型的细胞中起作用,是细胞脂质代谢的常见途径[15],适当利用细胞内的“脂肪噬”现象,可以作为治疗脂肪肝等细胞内有脂质堆积的疾病的方法[16]。基于上述研究结果,推测自噬干预可能是治疗SANFH 的新方向。

为验证研究假设,本研究构建了SANFH大鼠模型,并同时给予自噬干预,观察自噬干预对SANFH大鼠股骨头坏死的改善情况。结果显示,未实施自噬干预的大鼠股骨头坏死率为66.7%,平均坏死面积为(1.47 ± 0.19)mm2,给予自噬抑制剂后,大鼠股骨头组织细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白明显下降、p62 蛋白明显升高,股骨头坏死发生率为100%,坏死表面积为(2.27 ± 0.22)mm2,而当给予自噬激活剂时,LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白明显升高、p62蛋白明显下降,股骨头坏死发生率仅为33.33%,坏死表面积为(1.04 ± 0.15)mm2。这些结果表明,自噬干预的确在一定程度上能降低股骨头坏死的发生率,且局限了病灶范围。

为进一步明确自噬干预效果是否与脂质代谢、血管内皮改善有关,本研究评估了每组大鼠血脂和血清eNOS、NO、ET-1 含量。结果显示,使用激素后大鼠的脂代谢出现了轻度异常,且使用3-MA 抑制自噬后,TG、TCH、LDL 水平明显升高,HDL 水平明显下降,而使用雷帕霉素激活自噬后,TG、TCH、LDL 水平明显降低,HDL 水平明显升高,接近于正常值。此外,自噬干预后血清eNOS、NO及ET-1 含量同样出现了显著变化。与未实施自噬干预的大鼠相比,自噬活性被抑制的大鼠血清中eNOS、NO 含量明显降低,且ET-1 含量明显升高,而自噬活性被激活的大鼠eNOS、NO 含量明显升高,且ET-1 含量明显降低。众所周知,eNOS、NO是内皮损伤后进行修复并维持血管扩张状态最为重要的物质,对股骨头的滋养血管也十分重要。而ET-1 是内皮损伤后释放入血的一种缩血管物质,易使诸多滋养动脉出现闭塞。这些结果表明,自噬干预是通过调节脂质代谢和促进因高血脂导致血管内皮损伤修复,从而改善大鼠股骨头坏死情况。其机制在于:一方面血脂降低后,血液黏稠度下降,内皮损伤减轻,脂肪栓子减少或消失,脂质堆积减少或消失;另一方面自噬激活后,血管内皮释放大量eNOS 等内皮修复物质,减少了ET-1 等缩血管物质,维持滋养血管良好灌注。

综上所述,在激素进入机体并诱发SANFH 的过程中,脂质代谢紊乱发挥了关键作用,通过增强机体组织细胞自噬活性,可有效改善股骨头坏死的发生率和局限病灶范围。因此,诱导自噬可成为治疗SANFH 的新方向。本研究未就自噬干预效应的分子机制作进一步探究,后续还需要开展相关实验研究。

【Author contributions】QU Xiaoxiao:Conceptualization,Methodology,Writing original-draft.QIAO Qingyang:Methodology.CHEN Ning:Investigation.SONG Tongyang:Formal analysis.LI Yu:Resorces.LIU Shuyi:Conceptualization,Supervision,Validation,Writing Review and Editing.All authors read and aplproved the final manuscript as submitted.

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