乳制品中糠氨酸和乳铁蛋白常用检测方法综述

徐大江，马占峰，赵丽娟，李 波

哈尔滨市产品质量综合检验检测中心，黑龙江哈尔滨 150090

0 引言

随着经济的快速发展，人们对乳制品的需求日益旺盛。乳制品的消费价值绝不仅仅是脂肪、蛋白质、糖类、维生素等营养物质，还有其中存在的很多生物活性成分，其含量虽然少但作用却大，可以参与人体的重要生理功能。目前市场货架上最为常见的常温奶，所采用的加工工艺为超高温瞬时杀菌工艺，即用134 ℃左右的高温，把原奶瞬间消毒4 s，虽然可以杀灭细菌，但与此同时也破坏了牛奶中很多热敏感的活性物质。因此，2016年国家奶业科技创新联盟发起实施了推动奶业可持续发展的专项研究项目——优质乳工程，在提倡“优质乳产自本土”的同时，更是提倡用科学的低温巴氏杀菌工艺，即加工温度72~80 ℃，时间15 s，最大限度地保留了牛奶中的天然活性营养。

目前，国家优质乳核心标准规定，优质乳的技术指标除了主要包括脂肪、蛋白质、非脂乳固体、污染物[1]、真菌毒素、微生物、营养成分[2]等，还包括一些热敏感和生物活性物质指标如糠氨酸、乳铁蛋白等。本文从优质乳中热敏感和生物活性物质指标糠氨酸和乳铁蛋白的检测方法进行综述，为今后研究糠氨酸、乳铁蛋白的检测方法提供参考。

1 糠氨酸及其检测方法

糠氨酸是乳制品中美拉德反应早期所产生的系列产物之一，是判断乳制品受热程度的重要指标之一[3]，其和乳制品中活性营养成分含量负相关[4]。通过检测乳制品中的糠氨酸含量可以鉴定巴氏杀菌乳中是否掺入复原乳或添加乳粉、炼乳等，还可以确定乳制品的加工工艺参数[5~11]。目前，在乳制品中糠氨酸的主要检测方法有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法和毛细管色谱串联质谱法。

1.1 高效液相色谱法

2004年国际标准化组织国际乳制品联合会（IDF）发布的ISO18329和我国农业行业标准NY/T 939中检测乳制品中的糠氨酸含量的方法均为高效液相色谱法。何瑛等[12]进一步优化了流动相组合、色谱柱类型和酸水解条件，即选择了以三氟乙酸作为离子对试剂+甲醇的流动相体系组合，耐受高比例的水相以及更低pH流动相的HSS T3色谱柱，采用10.6 mol/L盐酸溶液进行酸水解试验，结果为：标准曲线线性的R2=0.999 7，方法检出限1.5 mg/100 g蛋白质，在5~30mg/L的加标浓度下，加标回收率91.48%~91.73%，相对标准差（RSD）值为0.13%~0.37%。黄文强等[13]也采用5 mL，0.1%三氟乙酸溶液流动相配制工作液，未采用腐蚀性的盐酸，避免盐酸对色谱柱的损伤，选择耐受低酸度流动相的C18 SB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μL）反相色谱柱，相对于普通C18 色谱柱，延长了色谱柱使用寿命，结果为：标准曲线线性的R2=0.999 0，加标回收率为90.6%~93.8%，测定含量135 mg/100g蛋白质时，RSD值为0.73%。

高效液相色谱法具有分离能力高、分离时间短、灵敏度高、柱效高、可反复使用、流动相可控等优点，但缺点是色谱柱造价比较高，乳制品前期处理时间长（24 h），糠氨酸上机液过酸容易导致色谱系统损坏等。

1.2 液相色谱质谱联用法

采用液相色谱质谱联用法检测乳制品中的糠氨酸，可先将样品中的蛋白质进行水解，选用固相萃取柱净化样液，利用液相色谱将净化液中的糠氨酸进行分离，再通过质谱采用正离子化模式和多反应监测模式对糠氨酸进行定性定量分析。具体步骤是在密闭的玻璃瓶中加入100 mg样品和4 mL 6mol/L的盐酸，封闭玻璃瓶，110 ℃烘箱中加热水解20 h，水解后过滤，取400 μL水解液使用氮气吹干，用流动相定容上机，检出限0.003 mg/L，线性范围0.009~1.000 mg/L[14]。

液相色谱质谱联用法的前处理方法与高效液相色谱法相似，具有简便、抗干扰、灵敏度高等优点。但液相色谱质谱联用法相对于高效液相色谱法对上机液和流动相要求更高，使得液相色谱质谱联用法的前处理过程更加复杂。

1.3 毛细管电泳与质谱联用法

毛细管电泳与质谱联用法是一种新型的分离检测技术，以毛细管为分离通道、利用待测物之间淌度和分配行为上的不同从而实现分离，再通过质谱检测样品离子强度以进行定性和定量，是分析生物大分子物质的有力工具。具体步骤是在样品水解完成后，过滤，然后使用氮气吹干；使用流动相定容上机；在使用毛细管电泳之前，新的毛细管电泳必需使用0.1 mol/L盐酸润洗5 min，之后，使用超纯水润洗5 min，以避免质谱中电喷雾电离源被污染[15]。毛细管电泳与质谱联用法的糠氨酸检出限为0.07 mg/L，定量限为0.25 mg/L，回收率为77%~97%。

毛细管电泳与质谱联用法对生物大分子具有较好地分离检测效果，但是毛细管电泳和质谱接口还存在一定缺陷，可能会降低检测灵敏度，维护成本较高。

2 乳铁蛋白及其检测方法

乳铁蛋白作为生鲜牛乳中的天然成分，具有广谱的抗菌、消炎、抑制肿瘤细胞生长及调节免疫系统等作用。“国家优质乳工程”提出钙和蛋白质只是乳制品的基础指标，天然活性营养才是乳制品真正的核心价值，而乳铁蛋白是优质巴氏杀菌乳天然活性营养之一。目前，尚未出台检测乳制品中的乳铁蛋白的国家标准，本文结合行业标准、团体标准等进行乳铁蛋白检测方法的总结，其常用检测方法有免疫学分析法，包括免疫扩散法、酶联免疫法、免疫层析快速检测法；色谱法，包括高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法、毛细管电泳法、凝胶电泳检测法。

2.1 免疫学分析法

2.1.1 免疫扩散法

免疫扩散法是将混有乳铁蛋白抗体的琼脂糖，凝冻后打一些小孔，以小孔为中心的抗原-抗体反应沉淀带环状区域被染色，通过观察沉淀带环的直径与乳铁蛋白抗原浓度的关系即可定量测定待测样品中乳铁蛋白的含量。龚广予等[16]建立随机免疫扩散法检测乳铁蛋白，通过乳铁蛋白与抗血清的免疫反应，经过了染色、脱色和清洗，最终测量到反应沉淀带的直径与抗体浓度成正比，证明免疫扩散法可用于检测乳制品中乳铁蛋白的含量。

该方法成本相对低廉，但操作步骤相对复杂，检测耗时相对较长，并且检测结果需通过人为精确测量环的直径才能得到结果，容易产生人为不确定度，故在实际检测中的应用并不广泛。

2.1.2 酶联免疫法

酶联免疫法是目前应用最广泛的免疫检测方法。它是使用与酶连接的抗原或抗体与乳铁蛋白抗体或抗原产生反应，再根据反应颜色的程度进行该抗原定性和定量的方法。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应的结果，从而使该方法有很高的灵敏度。丰东升等[17]用乳铁蛋白为抗原免疫小鼠，获得13 株单克隆抗体作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体为二抗，建立了牛乳铁蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法，最低检测限为0.05 ng/mL，检测范围为0.05~3.20 ng/mL。张英华等[18]应用酶联免疫法测定牛初乳中乳铁蛋白的含量，最小检出量为0.5 ng/mL，浅性范围为0.8~100.0 ng/mL，标准曲线相关性为0.996。郑云鹏等[19]采用市售乳铁蛋白酶联免疫试剂盒，检测了奶粉中乳铁蛋白含量，加标回收率为87.21%~115.6%，准确性高，优化后的样品前处理方案使得检测结果稳定性也更高。

酶联免疫法虽然灵敏度高，但因其特异性对试剂的选择性高，不能同时分析多种成分，仅能对单一蛋白质进行分析，不适合用于大批量的样品分析。

2.1.3 免疫层析快速检测法

免疫层析快速检测法是将免疫标记技术与层析技术相结合的一种检测技术。利用标记物的显色特性和层析的分离技术检测待测物。刘楚新[20]以转人乳铁蛋白牛奶为检测对象，研发出2 种胶体金免疫层析试纸条，实现了乳铁蛋白的快速检测，结果与常规检测方法一致，可作为牛奶中乳铁蛋白检测的有效方法。

该方法可对大量样本中的目标物质进行快速筛查，而且不需要对样品进行前处理，与其他化学检测方法相比，具有简便、快速、特异性强的优点。但该方法会出现假阴性和假阳性结果的风险，不适用于复杂乳制品及相关食品的检测，也不适用于执法机构进行判别确证。

2.2 色谱分析法

2.2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法是利用不同物质在固定相和流动相之间极性大小不同从而进行分离，并被特定检测器检测的一种检测技术。廖菁菁等[21]建立了高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的检测方法，即用0.08 mol/L磷酸氢二钠缓冲液在pH=8.0时提取样品，经肝素亲和柱净化处理，用C4反相色谱柱分离，DAD检测器于280 nm处检测，方法检出限为5 mg/100 g，回收率为81.0%~92.0%。梁政洋等[22]用水牛的乳蛋白多态性规律，建立指纹图谱快速区分水牛乳和荷斯坦牛乳，选择C8色谱柱；检测波长设定为215 nm；柱温：45 ℃；用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸乙腈进行梯度洗脱，分离出的κ-CN/A、αs2-CN、κ-CN/B、αs1-CN、β-CN、β-LgB、α-La峰面积相对标准偏差（RSD）＜5%，对乳蛋白进行分离后建立指纹图谱，当荷斯坦牛乳掺入2%时可被检测到。

该方法因具有反应灵敏、结果准确、重复性好等优点，可作为团体标准乳制品中乳铁蛋白测定的标准检测方法，但因乳制品的基质成分相对复杂，需要肝素亲和柱进行净化处理，对样品纯度要求较高，且设备昂贵。

2.2.2 高效液相色谱串联质谱法

高效液相色谱串联质谱法是通过肝素亲和色谱法纯化乳铁蛋白，然后用于筛选胰蛋白酶标记肽，选择特征肽，并通过高效液相色谱串联质谱法从纯化的水解产物中进行鉴定，进而实现乳铁蛋白定量检测。张敏等[23]建立了高效液相色谱串联质谱法测定牛乳和婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白含量的方法。具体步骤是将样品加水溶解，经过二硫苏糖醇和碘代乙酰胺溶液反应，加入胰蛋白酶进行酶解，用乙腈水溶液定容上机。标准曲线线性R2＞0.995，平均加标回收率为93.5%~117.1%，相对标准偏差为1.4%~6.7%。

该方法可用于牛乳中乳铁蛋白的测定，但前处理过程需将乳铁蛋白酶解，而活性与非活性乳铁蛋白均可参与此过程，致使最终的检测结果为样本中乳铁蛋白的总量，并不能区分样本中活性乳铁蛋白与非活性乳铁蛋白。

2.2.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法是以毛细管为分离通道、以高压电场为驱动力，根据待测物质分离柱效不同而实现分离的一种液相分离技术。该方法的柱效随分子量的增大而上升，而乳铁蛋白是生物大分子，可用该方法进行快速准确检测。刘宇等[24]建立的动态涂层毛细管电泳检测乳铁蛋白的方法，可检测出乳铁蛋白A、乳铁蛋白B、乳铁蛋白C、乳铁蛋白D，4 种不同乳铁蛋白原料的纯度，RSD分别为1.0%，0.8%，1.2%，0.9%。顾媛等[25]建立了婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的检测方法，样品经脱脂、去沉淀富集、过滤净化，结果为：标准曲线线性R2=0.999 2，平均回收率为92.8%。虽然毛细管电泳对生物大分子物质具有较好的分离检测效果，但是毛细管壁易吸附乳铁蛋白，导致检测重复性差，不能满足基体复杂样品中乳铁蛋白的测定。

2.2.4 凝胶电泳检测法

凝胶电泳检测法是选择一种能够与乳铁蛋白结合的DNA作为探针分子，根据DNA乳铁蛋白结合物与未结合乳铁蛋白的DNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率不同，结合条带的是否减少及减少程度，从而实现对乳铁蛋白含量的检测。孙娜娜等[26]建立了一种毛细管凝胶电泳检测乳铁蛋白的方法，利用乳铁蛋白和DNA序列的特异性结合，根据游离DNA峰面积减少程度实现乳铁蛋白的定性定量分析。

此方法无需借助色谱、光谱等大型仪器，无需样品预处理，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测具有快速、低成本、通量高的特点，但操作相对繁琐，不适合大批量样品的测定。

3 结论

随着乳品企业开发高品质乳制品力度的加强，灵敏、可靠、快速、容易普及的检测方法和手段也急需跟进，为乳制品的安全保驾护航。传统的检测方法有些方法简便，但灵敏度差；有些虽然灵敏度高，但样品处理繁琐、仪器昂贵，因而不适于高频次、高通量的检测。未来建议继续重点开发高效、快捷的检测方法和检测设备，以提高乳制品中糠氨酸和乳铁蛋白的检测效率。