不同检测时间对原料乳中嗜冷菌检测结果的影响

张鹏博，李智星，魏 勇，张逸雪，刘文楷，蒋 松＊

1 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000

2 新疆天润乳业股份有限公司，新疆乌鲁木齐 832063

0 引言

嗜冷菌作为影响牛奶质量的一类微生物，其数量的多少直接影响牛奶的风味、口感以及成品乳的保质期[1]。牛奶中嗜冷菌数量最佳的范围是在1.0×103CFU/mL以下，嗜冷菌超过1.0×103CFU/mL则会与牛奶中的乳蛋白、乳脂肪等作用生成酶，产生凝结块及脂肪氢化味[2]。在我国现行的生鲜乳收购标准《GB19301—2010 食品安全国家标准 生乳》中规定，生鲜乳中微生物菌落数在2.0×106CFU/mL 以下为合格乳。但一些欧美国家则以嗜冷菌在1.0×103CFU/mL以下为生鲜乳的收购标准，因此国内乳品企业愈发地重视嗜冷菌的防控，部分优秀乳品企业提高了嗜冷菌的合格标准，以进一步保障乳制品的质量安全。

我国乳及其制品中嗜冷菌的菌落总数标准测定方法为《NY/T 1331—2007 乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》中的MPC平板计数法，即取乳样加入指定培养基后于6.5 ℃条件下培养10 d，该方法计数结果准确[3]。但国标检测方法周期长，追溯问题原因困难，各乳品企业执行的检测标准不同，对原料乳中嗜冷菌数量的检测方法也不同。现阶段有直接荧光过滤法、流式细胞术和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）法等直接检测方法，但也均有各自的优缺点。此外，以上方法的从生鲜乳采样到检测之间都会存在一定的时间间隔，间隔时间不同，均会对检测结果造成不同程度的影响。因此，本研究对比了《NY/T 1331—2007 乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》中的MPC中平板计数法在不同检测时间时，原料乳中嗜冷菌水平差异，为提高原料乳中嗜冷菌检测的准确性，制定更加合理的嗜冷菌检测标准流程提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备

嗜冷菌培养基，北京陆桥计数股份有限公司；生化培养箱，上海博远医药生物仪器股份有限公司。

1.2 样品采集

本试验采集新疆部分地区的10个牧场（其中3个现代化牧场、4个传统牧场、3个养殖小区）的奶罐车生鲜奶样，共计120 份（现代化牧场39 份、传统牧场51 份、养殖小区30 份），奶罐车混合生鲜乳样本收集前按照奶样取样搅拌标准进行完全混合，遵守无菌采样规程，选取上中下三等分混合采集于无菌采样瓶中采样后摇匀即时放入4 ℃冰箱中保存。

1.3 检测方法

同一份奶样，在取样后即时进行检测，之后将样品放入4℃冰箱中保存，在取样后12 h和24 h后再次进行检测。

检测过程严格按照《NY/T 1331—2007 乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》中的MPC中平板计数法进行检测。检测前准备高温灭菌后的培养皿、无菌吸管及稀释液，在无菌环境下，对样品分别进行10-2和10-3倍稀释，每个稀释梯度做3个平行，结果采取平均值，并以相应稀释液做空白对照，接种于培养皿后，待其凝固后放置6.5 ℃的低温培养箱中培养10 d。10 d后将培养好的嗜冷菌用平板计数法计数，粘连菌群不分层记作1，分层另计数，最终统计样品总数。

1.4 数据分析

本试验所得数据使用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，并利用Duncan法进行多重比较，以P＜0.05表示差异显著；以P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 10-2稀释梯度下相同养殖模式牧场不同时间嗜冷菌检测结果对比

由表1可见，在10-2稀释梯度下，现代化牧场即时检测结果和间隔12 h和间隔24 h的检测结果差异均显著（P＜0.05）。传统牧场即时检测结果与间隔12 h和间隔24 h的检测结果差异显著（P＜0.05）；间隔12 h与间隔24 h的检测结果差异不显著（P＞0.05）。而养殖小区即时检测结果与间隔24 h的检测结果差异显著（P＜0.05），与间隔12 h的检测结果差异不显著（P＞0.05）；间隔12 h和间隔24 h检测结果差异不显著（P＞0.05）。

表1 10-2稀释梯度下相同养殖模式牧场不同时间嗜冷菌检测结果对比

2.2 10-3稀释梯度下相同养殖模式牧场不同时间嗜冷菌检测结果对比

由表2可见，在10-3稀释梯度下，现代化牧场即时检测结果和间隔12 h和间隔24 h的检测结果差异均显著（P＜0.05）。传统牧场即时检测结果与间隔12 h和间隔24 h的检测结果差异显著（P＜0.05）；间隔12 h与间隔24 h的检测结果差异不显著（P＞0.05）。而养殖小区即时检测结果与间隔24 h的检测结果差异显著（P＜0.05），与间隔12 h的检测结果差异不显著（P＞0.05）；间隔12 h和间隔24 h检测结果差异不显著（P＞0.05）。

表2 10-3稀释梯度下相同养殖模式牧场不同时间嗜冷菌检测结果对比

3 讨论

嗜冷菌是一类在低温条件下仍可以生长的微生物[4]。这就导致了原料乳在4 ℃保存时嗜冷菌仍能生长繁殖。嗜冷菌在牛奶中与其主要营养成分作用生成耐热酶，并且这些耐热酶无法通过高温降解，导致商品乳中营养成分大大的遭到破坏。人们在不断地追求牛奶品质的提升，将原料乳中嗜冷菌菌落总数控制在合格的范围内即可对牛奶品质造成最小的影响。由此，检测嗜冷菌对牛奶品质的判定就显得尤为重要[5]。

根据各牧场的数据反馈，牧场实验室嗜冷菌检测总数要远远小于乳品厂实验室检测，主要原因有两点：其一，新疆地区占地面积较大，原料乳在运输中路途遥远，虽然运输过程会保证奶罐温度恒定，但原料乳是嗜冷菌良好的培养基，这使得嗜冷菌仍然会生长繁殖[6]，而这会导致实验室检测与牧场自检的结果相差甚大。其二，考虑到原料乳中需要检测的指标较多，采样后不能即时进行微生物检测，样品需要冷藏，与上述原因同理，导致样品中嗜冷菌不断繁殖。本研究结果表明，在10-2和10-3两个稀释梯度下，3个不同模式牧场嗜冷菌结果均随着检测间隔时间的增加而增加，其中现代化牧场和传统牧场嗜冷菌即时检测结果和间隔12 h和24 h的检测结果均存在显著性差异，而由于养殖小区多为散户家养，管理不统一，导致原料奶的嗜冷菌菌落总数差异较大，又因平板计数法统计菌落总数的局限性，导致养殖小区嗜冷菌即时检测和间隔24 h差异显著（P＜0.05），间隔12 h检测结果与即时检测和间隔24 h检测结果无显著差异（P＞0.05）。

由此可见，虽然降低牛奶嗜冷菌数量的主要任务在于牧场的严格把控，但数据的准确性在于检测人员对国标法的严格执行，因此在不能缩短奶车运输的前提下，可以缩短采样至检测的时间间隔，使数据更具有说服力，以确定嗜冷菌污染的真正原因。在4 ℃冷藏原料乳的条件下，嗜冷菌仍能较快的生长繁殖，并逐渐演变成原料乳中的优势菌群，故应缩短生鲜乳从挤出的一刻到消杀灭菌的时间，以有效地控制原料乳中嗜冷菌的增长。同时，牧场也应对奶厅进行严格规范的卫生管理，对工作人员加强培训，从根本上解决牛奶中嗜冷菌基数大的问题[7]。

4 结论

检测间隔时间对原料乳中嗜冷菌检测结果存在影响，样品检测间隔时间越久，最终检测出结果越大，导致最终结果不具有准确性和说服性。