巩膜生物力学改变与青光眼性视神经损伤

狄冠州 原慧萍

(哈尔滨医科大学附属第二医院眼科 哈尔滨 150086)

青光眼是不可逆性致盲的首要原因，预计到2040年，全球青光眼患者人数将增加到1.118亿人[1]，目前导致青光眼视神经不可逆损伤的主要危险因素是眼压升高[2]。然而，在我国原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)患者中有51.43%～83.58%为正常眼压性青光眼(normal tension glaucoma，NTG),在这些患者中，即使眼压正常或低于正常水平，视神经仍有不可逆的持续损伤，从而导致视觉功能逐渐丧失[3-4]。此外，不同患者在相同眼压下视神经受损的程度亦不尽相同。这些现象提示，高眼压并非青光眼唯一的危险因素，个体对眼压的耐受性也不尽相同。因此，认识青光眼性视神经损伤除眼压之外的相关因素，对保护青光眼患者视功能具有重要意义。有研究[5]表明，巩膜生物力学改变在青光眼引起视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)轴突损伤中起重要作用。本文就巩膜的基本生物力学特性、巩膜胶原纤维结构与青光眼、巩膜重塑与青光眼、巩膜刚度与青光眼、巩膜通透性的变化与青光眼进行综述，以便为保护青光眼患者视功能提供新的治疗策略。

1 巩膜的基本生物力学特性

巩膜约占眼球外层纤维膜的5/6，在前部与角膜相连，后部与硬脑膜鞘相连，是一层以胶原蛋白为主要成分的、结构复杂的结缔组织。巩膜从内向外分为棕黑层、基质层和巩膜表层。基质层在巩膜的中间，构成巩膜的主体结构，主要由胶原纤维夹杂微少的弹性纤维构成。基质层中组织排列呈一层一层交错铺叠的形式，每一层的胶原纤维相互交织，直径介于6～50 µm间[6]。因此，胶原纤维在维持巩膜的结构、功能和生物力学特性方面发挥着重要作用。后巩膜在视盘处分为2层，外2/3形成巩膜管，内1/3形成筛板，筛板是一种不规则的网状结构，视神经由此处走行穿出眼球。检测巩膜生物力学最常用的方法是巩膜应力应变行为的单轴拉伸实验。目前研究者们已经在人和多种动物(猴、猪、狗、牛、兔)实验中证实巩膜是一种非线性材料(应力和应变关系呈非线性的材料)，在受到应力时，胶原纤维的自然卷曲逐渐拉直来承受载荷[7-11]。这些研究也证实了巩膜是一种黏弹性材料，在外力作用下，弹性和黏性2种变形机制同时存在的材料，同时也具有明显的滞后性，即材料应变落后于应力的性质。正常巩膜在研究中表现出明显的机械各向异性，即在相同外界条件下，材料在不同方向上性质具有差异性，并且在不同解剖位置的机械各向异性也不尽相同。有研究表明，与前巩膜和赤道巩膜相比，后巩膜的胶原纤维排列更松散同时其弹性模量更低，这意味着在相同的应力条件下后巩膜更容易发生形变。

巩膜生物力学性质的变化与衰老、疾病和机械刺激引起的巩膜基质的重塑有关[12]。眼压引起的机械刺激使巩膜产生应变，当眼压在正常范围中波动时，由于巩膜具有一定的刚度以及黏弹性，巩膜基质的形变处于相对稳定的平衡状态。如果眼压相关的应力超过巩膜正常形变的弹性范围，那么巩膜的胶原纤维结构及其生物力学特性将会发生不可逆转的改变[13-14]。巩膜作为在眼压波动时维持眼球形态的主体结构，其力学性质的改变会影响眼压对其作用的应力而产生的应变大小，同时也会影响在筛板中走行的RGC在眼压升高时的受损程度，所以上述巩膜生物力学特性的改变可能是导致青光眼视神经损伤的原因。

2 巩膜胶原纤维结构与青光眼

目前，眼压升高仍然是青光眼的主要临床表现，眼压变化带来的机械刺激改变了巩膜的胶原微结构，主要是胶原的排列程度，同时也改变了巩膜的生物力学性质[15-16]。多项研究[16-19]表明：在青光眼患者和慢性眼压升高的动物中，巩膜的胶原结构与正常眼是不同的。研究者使用广角X射线散射(wide-angle X-ray scattering，WAXS)和小角度光散射(smallangle light scattering，SALS)测量了人尸体眼中胶原纤维组织的排列差异。Pijanka等[16]使用WAXS分别观察青光眼和正常眼视乳头旁巩膜组织(peripapillary scleral，PPS)的胶原分布情况，结果显示青光眼患者的颞上和鼻下2个象限的纤维排列有序程度降低。后来其他研究者观察到，基于青光眼轴突丢失，从正常、青光眼未受损到青光眼受损时，PPS中的胶原纤维在各个方向上的分布数量越发趋向于均匀[17]。胶原纤维排列的变化影响着巩膜的各向异性，PPS处的各向异性的改变可以影响筛板对于眼压升高的应变程度[18]。有研究者[19]在SALS下发现，与正常人巩膜组织相比，青光眼患者的鼻侧象限巩膜组织中的纤维排列更为有序，而在上方象限中却恰恰相反，青光眼患者此处的纤维排列较为散乱。二者的胶原纤维排列的差异说明在青光眼的病程中，胶原纤维为了适应内部应力的变化而改变了其排列方式，而这种改变是为了减少视神经损伤的代偿改变，还是青光眼造成的最终病变，目前还没有定论。在实验性青光眼的小鼠眼中，PPS处胶原的排列也表现出更大的各向异性。研究者发现与对侧对照眼相比，人工诱导的慢性眼压升高的鼠眼中，巩膜胶原纤维排列方向上的有序程度更低[20]。这可能是为了抵抗眼内压力升高所带来的形变趋势。Cone等[21]使用透射电镜对青光眼小鼠巩膜胶原结构进行了仔细的观察后发现，其PPS厚度增加，但非胶原纤维成分减少，这说明PPS中胶原纤维的总体积在增加。他们还观察到直径较小的胶原纤维数量增加而直径较大的纤维数量明显减少，同时也发现纤维细胞的层数增加，这可能是原有的层状结构被破坏表现出更多的分层，纤维层状结构的破坏也可能是青光眼PPS中纤维排列更加散乱的原因，但是没有更直观的证据。

3 巩膜重塑与青光眼

有研究[15,17,22]发现，动物模型和青光眼患者的巩膜力学行为的改变与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的改变有关。巩膜成纤维细胞是组成巩膜的主要细胞成分，并且对巩膜ECM的合成、降解起重要作用。正常状态下，巩膜成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖和糖蛋白等胞外基质成分[23]。小鼠PPS透射电镜成像显示，1/4的视乳头旁巩膜层由成纤维细胞组成，并且在实验性青光眼中，巩膜成纤维细胞层占更大比例[21]。巩膜成纤维细胞在巩膜ECM的重塑中起至关重要的作用[24-25]。而ECM重塑的核心是成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化[26]。这种转变以细胞增殖、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和肌球蛋白Ⅱ等收缩蛋白的表达增加、细胞迁移为特征[27]。促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的重要刺激因素是机械微环境和生长因子TGF-β的变化[28]。有研究者[29]在人眼PPS体外组织培养中发现，高强度和高频率的机械应变会促使成纤维细胞向肌成纤维细胞改变。这说明眼压升高对巩膜的应力作用可能会促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。同时其他研究者[30]在体外培养筛板组织时发现，在更硬的培养基中肌成纤维细胞的数量增加，青光眼变硬的巩膜基质可能为成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化提供了条件。此外，有证据[31]表明，TGF-β在青光眼患者以及青光眼动物模型视神经乳头(optic nerve head，ONH)中表达的增加。并且青光眼小鼠巩膜中TGF-β活化蛋白、血小板反应蛋白水平也高于对照组[27]。青光眼对巩膜生物力学的影响可能是通过各种途径促进肌成纤维细胞的产生和表达实现的。

4 巩膜刚度与青光眼

刚度即某种材料受到应力时抵抗形变的能力，刚度越大在受力时越不容易形变。而巩膜作为一种具有黏弹性的材料，刚度也是其重要的生物力学特性之一。2005年Sigal等[32]通过人眼的计算机模型预测了可能影响ONH损伤的影响因素，影响最大的5个因素中巩膜刚度排在首位。对巩膜材料刚度的分析中发现，所有区域的巩膜初始切线模量(刚度的度量值)较低，而在被施加较高的应力后，其刚度逐渐增加[8]。其他研究者在猴眼中发现了同样的现象[33]。2009年Thorn等[34]经研究发现，眼压升高会使猪眼PPS、视神经以及筛板均发生硬化，并且PPS的硬化会降低视神经头对眼压升高的生物力学敏感性。而后在2014年Kimball等[35]的研究表明，PPS的生物力学性质的改变可以影响筛板的顺应性以及轴突损伤的程度。因此，了解PPS的刚度变化对认识RGC轴突损伤具有重要意义。在猴眼中，随着眼压从 5 mmHg (1 mmHg=0.133kPa)增加到45 mmHg时，PPS的结构刚度呈现高度非线性增加。45 mmHg处的平均切线模量比10 mmHg处高3～6倍。并且当眼压超过30 mmHg时，后巩膜明显变硬[33]。而后Coudrillier等[17]的实验也支持这一观点。该研究对比了正常眼和青光眼患者的巩膜生物力学，发现二者的巩膜有着显著的不同。青光眼患者比正常眼在子午线方向上拥有更大的应变，同时基质硬度和纤维刚度也更大，而在青光眼患者中，RGC损伤对巩膜基质硬度未见明显的影响。Dikici等[36]运用超声剪切波成像技术对比了21例POAG患者与年龄相匹配的21例健康人的ONH与PPS的刚度后发现，青光眼患者的ONH与PPS中的各个测量位置的刚度均大于健康人，这与之前的研究结果相一致。

Kimball等[35]团队对CD1小鼠结膜下注射甘油醛胶增加巩膜胶原纤维原的交联使其巩膜硬度增加，变硬的巩膜却没有为RGC提供更好的保护效果，这些改变使小鼠RGC轴突更容易因为眼压升高而受到损伤。在胶原8A2基因突变的Aca23小鼠中,眼球的轴长和横径都明显大于野生型B6小鼠，并且在慢性眼压升高时表现出更强的抵抗形变的能力，与野生型小鼠相比，在RGC受损时突变型小鼠的RGC受损程度更轻[37]。这2个实验得出了相反的结果，可能是因为改变巩膜力学性质的原理不同而使实验结果产生差异。由于实验技术的局限性，在体测量巩膜刚度很难实现，很多研究者通过升高眼压后观察筛板在眼压变化后的位置改变情况，以此来观察筛板的顺应性。有研究者[38]使用光学相干层析成像(optical coherence tomography，OCT)获得眼后部图像及数据并使用虚拟场法(virtual fields methodd，VFM)比较了健康人、高眼压症(ocular hypertensive，OHT)患者、POAG患者以及原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)患者的筛板刚度，他们发现OHT、POAG、PACG患者的筛板刚度大于健康人。由于样本量较小所以这个结果没有统计学意义，但是这项研究的结果验证了离体测量实验中的结果，并且为在体测量巩膜生物力学性质提供了新的思路。Fazio 等[39]在对比了欧洲和非洲人种的差异后发现，与欧洲组相比，非裔组的PPS随年龄增长而变硬的速度更快,同时非裔的青光眼发生率高于欧洲组。这个结果可能支持了巩膜老年性硬化是青光眼RGC损伤的危险因素。目前有的研究者[40]认为，巩膜刚度的增加是为了抵抗高眼压带来的形变，但是随着年龄的增加巩膜基质发生硬化，这使老年人更容易发生青光眼视神经病变。这些矛盾的结果可能提示了老化与青光眼对人眼巩膜硬化的促成机制不同。

青光眼病程中，巩膜、PPS、筛板刚度的增加意味着在同等应力下组织更难发生形变。然而在眼压升高的过程中筛板向后凹陷变形不仅仅是机械压力直接作用的结果，而是巩膜、PPS、筛板作为一个生物力学系统产生的反应[41-43]。巩膜刚度的增加限制了应力增大情况下视神经管的扩张[44]，使水平方向上筛板受到的向外将其绷紧的力减小，从而使筛板产生了更大的形变。我们可以将其想象成金属外壳连接了一个弹力网，当内部压力无法使金属外壳形变时，弹力网将产生更大的形变。

5 巩膜通透性与青光眼

Pease等[45]选用3种小鼠(B8、CD1、Aca23),在每只小鼠的前部巩膜上选取2个或2个以上的观察位置，并记录了右旋糖酐分子在3种小鼠的PPS以及观察位置上的扩散速率，以确定巩膜通透性的差异。在同样条件下诱导为实验性青光眼时，3种小鼠的巩膜通透性都有不同程度的降低。同时，他们发现CD1小鼠在乳头周围巩膜区域的通透性要低于B6和Aca小鼠，并且CD1小鼠的RGC轴突受损数量更多。这证明了青光眼可以导致巩膜通透性降低。

巩膜的通透性改变往往是因为胶原结构的改变，提示巩膜的生物力学结构发生了改变。Kimball等[35]在一项增加巩膜胶原纤维交联度的实验中也发现：交联度增大，巩膜通透性降低，并且对RGC的保护能力更弱。

综上所述，有关青光眼巩膜生物力学的研究近年来取得了很大进展，但仍有很多方面需要探索。首先，青光眼性视神经损伤主要与眼后部巩膜的生物力学变化有关。由于很难在活体上直接测量后部巩膜的生物力学变化，所以只能通过计算机建模来评估眼后部巩膜的生物力学性质。但是，随着对活体巩膜生物力学测量的需要和科技的发展，活体测量会成为未来研究的趋势。其次，由于青光眼病程漫长，对尸体眼的研究只能得到青光眼对人眼损伤的最终结果以及巩膜性质的最终改变，而对于其病程中的阶段性改变我们无从得知。此外，巩膜生物力学性质的改变往往不是单一的改变。随着结构的变化，多种性质的改变通常是同时发生的。这对我们研究青光眼损伤的病理机制又是一项新的难题。最新的研究发现，高眼压青光眼和NTG的筛板存在差异，NTG患者拥有更薄且弯曲程度更大的筛板。这再次提示研究巩膜生物力学对明确青光眼的损伤机制有着重要意义。研究青光眼患者的巩膜生物力学性质的改变，对青光眼患者RGC损伤的修复、维持其视功能至关重要。