植物样品中硒形态分析的前处理技术

王文静，陈 通，崔琬晶，郭亚飞，潘秀云，邓天龙,*

(1.海洋资源化学与食品技术教育部重点实验室，天津科技大学 化工与材料学院，天津 300457；2.湖北省益欣盐产业技术研究院有限公司，湖北 孝感 432400)

1 前言

作为人类生命必需的十四种微量元素之一，硒在人体中发挥着不可或缺的作用。通过合成谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还原蛋白还原酶、蛋氨酸亚砜还原酶等氧化还原酶，清除有害自由基及过氧化物，起到抗衰老作用[1]。硒还能保护细胞结构，调节细胞免疫，提升机体免疫力，并在预防心血管疾病，拮抗重金属和污染物、抑制肿瘤、护肝、防治风湿及呼吸道疾病等诸多方面起到重要的作用[2]。人体所需的硒大部分靠膳食获取，直接或间接来源于植物。

硒可分为无机硒和有机硒两大类。植物样品中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ) 等无机酸较少，大部分以硒蛋白、硒多糖、硒核酸等大分子硒及硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代乙硫氨酸(SeEt)等小分子有机硒化物的形式存在[3]。如在壶瓶碎米荠中，主要以硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸的形式存在，富硒西兰花中主要以硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸形式存在，富硒大豆主要是硒代蛋氨酸以及少量的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和亚硒酸盐[4]。不同形态硒的营养功能、安全性、生物活性差异明显，因此植物中硒形态的分析对合理开发富硒植物和科学补硒至关重要。

然而，植物中硒的形态种类繁多且不稳定，且各形态的硒含量较低，其形态分析检测具有挑战性。因此，科学合理的前处理对方法的构建至关重要。在前处理过程中，既要避免原始硒形态的转化，又不能引入污染物，并能满足具体检测需求。在此基础上，简便、高效、绿色的前处理技术受到越来越多的关注。

实验中常采用湿法消解、微波消解、石墨炉消解、干灰化等方法处理植物样本以测定其总硒含量[5]，但由于这些方法反应剧烈，容易使蛋白质发生变性或者分解，各硒形态被破坏或发生转化，因此不能应用于硒的形态分析。植物样品基体复杂，硒与氨基酸、蛋白质等相结合形成各种小分子或大分子形态，种类复杂多样，需要根据硒的形态与植物样本的特点、检测需求采取相应的前处理技术。

2 植物样品硒形态分析的前处理技术

2.1 液相萃取法(LPE)

液相萃取法是硒形态分析中应用最为广泛的前处理技术，主要包括水提取法、酸提取法、醇提取法、酶提取法、加压液体萃取法等方法。为提高提取效率，同时会辅以搅拌、震摇、离心、超声、微波等技术[6]。超声辅助提取是通过超声波使溶液中分子运动频率和速度增加，溶质溶剂充分接触，从而提高提取效率；微波辅助提取则是根据物质吸收微波能力的差异性，加速样品和溶剂间的相互作用，达到提取目的。

2.1.1 水提取法

水提取法是以去离子水为溶剂提取样本中水溶性硒的前处理方法，适用于游离的无机硒或者非结合蛋白形式的小分子硒，如硒酸钠、亚硒酸钠、甲基硒代半胱氨酸等，对于以结合蛋白形式存在的大分子硒的提取效果则较差[7]。傅世利等[8]采用超声水提法处理冻干后的脐橙样品，经UPLCQ-TOF-MS法测定，脐橙中SeCys2、MeSeCys和SeMet 3种形态硒的加标回收率在78.8%～92.9%之间，RSD在2.1%～7.5%间。陆奕娜等[9]针对富硒茶叶、大米样品，建立了水提法前处理、高效液相色谱—电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)联用技术测定7种硒形态的方法，该法确定了提取最优条件为超声下提取2 h，提取次数为1次。张弛等[10-11]在富硒萝卜叶、荸荠中硒的赋存形态及分布研究中采用水提法对可溶性硒进行提取，测得富硒萝卜叶中硒水溶性蛋白硒的含量占总硒的26.78%，荸荠中水溶性蛋白质中硒的含量为17.16 μg/g。Ogra等[12]与Auger[13]等也分别将水提取方法应用到对大蒜中硒的提取过程。水提取法操作简单，环境友好，经济节约，但也存在着提取效率低、适用范围窄的缺点。

2.1.2 酸提取法

仲娜[14]采用HPLC分离技术联用ICP - MS检测技术分析富硒海带样品中的硒形态，在前处理提取剂的选择上，比较了0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH、20 mmol/L NH4AC-CH3OH(5%)及蛋白酶XIV四种提取剂，发现使用0.1 mol/L HCl为提取介质、超声辅助处理时可成功提取出Na2SeO3、MeSeCys等4种硒形态，其他提取剂则提取硒的种类少或效率低。姚真真等[15]采用HPLC-ICP-MS测定苹果中SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅵ)、SeMet、Se(Ⅳ)等5种硒形态，研究发现采用盐酸为提取剂时加标回收率差、采用链酶蛋白酶为提取剂时回收率的时效性差，而采用5 mmol/L柠檬酸为提取剂时回收率及时效性均较好。Cankur等[16]研究发现室温下用0.1 mol/L HCl溶液水解24 h可以有效地从莳萝的叶、茎及根部提取小分子的硒。酸提取法多采用盐酸、柠檬酸为提取剂，提取率较高，但容易造成硒形态的破坏或者转化。

2.1.3 醇提取法

李娜[17]以大米和茶叶中的硒为研究对象，比较沸水、高氯酸—乙醇、甲醇—水、酶4种提取剂效果，得出甲醇—水提取效果最好，提取效率近 80%，进一步优化提取条件，建立了植物产品中4种常见硒形态的HPLC-HG-AFS分析方法。韩丹[18]用阴离子交换色谱连接氢化物发生——原子荧光光谱法(LC-HG-AFS)测定了用甲醇——水处理的植物样品，得到SeCys、Se(Ⅳ) 、SeMet和Se(Ⅵ)的加标回收率分别为 95.7%、106.9%、93.3%和91.4%。Ouerdane等[19]在研究芥菜籽中的硒代葡萄糖苷时，发现其易在水提取过程中不稳定而造成损失，而在70%甲醇溶液中则有较好提取效果。醇提取法一般用于有机硒的提取，成本相对较高。

2.1.4 酶提取法

酶提取法一般在较为温和操作条件下进行，各硒形态之间的转化少，因而是液相萃取法中应用最广泛一种提取方法，常用的酶有蛋白酶K、蛋白酶XIV、链酶蛋白酶、胃蛋白酶等。陈贵宇等[20]采用蛋白酶K为提取剂，超声1 h处理富硒茶叶，经HPLC-ICP-MS分离检测，SeCyS2、SeMC、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 5种硒形态在梯度洗脱下短时间得到了完全分离，加标回收率在 91.8%～109.4%之间。曹玉嫔[21]以马卡、牛蒡为研究对象，超声波辅助蛋白酶K-脂肪酶提取法进行前处理、HPLC-ICP-MS法进行测定，SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet和Se(Ⅵ)4种硒形态加标回收率在95.4%～108.0%，并应用于田七7种形态硒的提取。超声和微波是酶提取法常用的两种辅助方法，曾凤泽等[22]研究发现微波辅助提取相对于震荡和超声更能保持酶的活性，采用微波辅助蛋白酶XIV前处理、HPLC-ICP-MS联用技术测定灵芝中的6种硒形态，提取率高达99.2%，加标回收率 91.7%～98.7%，RSD0.031%～3.2%。秦冲等[23]亦采用微波辅助蛋白酶XIV测定富硒小麦，在37 ℃提取30 min，SeMet和SeCys2即可达到最大提取量。酶提取法提取率高，但耗时较长，需要超声、微波等技术的辅助。此外，酶解法适用范围广，可根据硒的赋存形态合理选择酶种类。

2.1.5 加压液体萃取法

加压液体萃取是在较高温度和压力下采用常规溶剂对固体或半固体待测物进行提取的技术，具有提取时间短、溶剂消耗少、稳定性高等优点。加速溶剂萃取仪 (ASE ) 的成功研制，使该技术实现仪器化，变得自动化、高效化[24]。Peachey等[25]通过ASE萃取系统用水和酶处理富硒水芥菜，处理后的样品经HPLC - ICP - MS测定显示，其含有SeMC、SeMet、硒酸盐、亚硒酸盐等多种形态的硒。

加压液体萃取在传统液相萃取法的基础上大大缩短了提取时间，同时在安全性、节约性方面优点显著，具有良好的发展前景。

2.1.6 其他液相萃取法

除以上几种常用的提取方法，其他液相萃取的方法还有盐提法、碱提法等，或是将几种提取方法协同。胡婷[26]优化了HPLC-UV-HG-AFS法测定植物中4种硒形态的方法，研究发现超声辅助25 mmol/L乙酸铵的前处理方式可将植物样品中4种硒形态成功分离，分离度、回收率均能满足实验要求。韩婷婷等[27]建立了以1.5 mol/L KOH为提取剂、IC - HG - AFS检测胶州湾海产品中硒形态的方法，分析海带中硒的加标回收率为87%，相对标准偏差RSD3.2%。张路梦[28]、高二东[29]分别采用碱提法提取富硒茶叶中的硒蛋白，证明了茶叶中硒蛋白多呈碱溶性。Stefanka等[30]采用水——胃蛋白酶—胰蛋白酶三步法提取法处理蘑菇样品，成功提取出4种形态的硒，提取效率高于一步提取法。Mounicou等[31]为研究大蒜中的硒形态，建立了一种顺序提取法，依次用水、酶、盐酸、亚硫酸盐，二硫化碳处理样品，该方法可以根据硒的不同来源(水溶性结合硒、细胞壁结合硒、蛋白质结合硒、元素结合硒和硒化物)有针对性的提取不同形态的硒。

2.2 固相萃取法(SPE)

作为一种常用的前处理技术，固相萃取法主要用于液体样品分离、纯化、浓缩。Yan等[32]制备了5-磺基水杨酸功能化磁铁矿纳米粒子，成功提取出腐乳汁中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet及SeCys2四种硒形态。Yathavakilla等[33]采用阳离子交换固相萃取结合ICP-Ms检测出芥菜叶片中含MeSeMet、MeSeCys及少量SeMet。孟昭荣等[34]制备了一种交联壳聚糖，用以富集蓝莓样品中的痕量硒，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的加标回收率分别在96.6%～107.3%与96.9%～106.3%之间。Torres等[35]采用XAD树脂作为橄榄油样品预浓缩的吸附剂，采用UPLC-ESI-MS法测定，硒氨基酸的回收率在84%～97%之间，检出限为0.09 μg/kg。固相萃取法在富集的同时又能除去杂质，相较于液相萃取法，该法试剂消耗少，富集倍数高、选择性强，容易实现与分析仪器的联用。但是，只能处理液体样品的特点增加了该方法的局限性。

2.3 液相微萃取(LPME)

液相微萃取是在液相萃取的基础上发展而来的一种新型绿色前处理技术。其原理是目标物在样品和提取剂之间达到分配平衡，从而实现目标物的提取。根据取样方式可分为直接液相微萃取、顶空液相微萃取等。Chen等[36]采用悬浮液滴固化微萃取法结合电热汽化电感耦合等离子体质谱法检测茶叶中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)及有机硒，该方法RSD在5.5%以内，富集因子高达500。熊珺等[37]建立了顶空单滴液相微萃取与GC-MS联用测定食品中挥发性有机硒的方法，将该方法应用于大蒜中二甲基硒和二甲基二硒的分析，两者的加标回收率分为93.5%和90.6%。与传统液相萃取相比，液相微萃取具有试剂消耗小、操作简单、环境友好等优点，且能集采样、萃取、浓缩步骤为一体，便于实现与仪器的联用[38]，在痕量元素的分析中潜力极大。

2.4 固相微萃取(SPME)

固相微萃取是一种新型的前处理方法，与固相萃取不同，其原理并非是萃取全部待测物，而是基于待测物在水样和固定相涂层之间的分配。根据萃取方式，分为直接法、顶空法、膜保护法等。平衡后的纤维头可直接插入GC或HPLC的进样室，样品经热解进入色谱柱，实现快速测样。Gionfriddo等[39]基于广泛应用的固相微萃取结合—气相色谱—三重四极质谱(SPME-GC-QqQMS)方法，提出了一种新的富硒和普通马铃薯硒形态的分析方法，使用氯甲酸丙酯-丙醇混合物初步衍生后按照以上方法提取、分离、检测，SeMet、MeSeCys回收率82.3%～116.3%。龚亮等[40]选择二乙烯苯—碳分子—聚二甲基硅氧烷为吸附涂层，建立了顶空固相微萃取结合GC-MS测定食品中两种挥发性有机硒的方法，将该方法应用于大蒜，检测出二甲基硒(DMSe)和二甲基二硒(DMDSe)的含量分别为4.87 μg/kg和0.25 μg/kg，加标回收率在84.6%～102.5%，相对标准偏差7.1%～9.4%，可用于食品中挥发性有机硒的分析。固相微萃取无需溶剂、简单快速、安全性高，且装置便携，易实现自动化，近年来发展迅速。

完整的硒形态分析不仅包括前处理，还有后续的分离与检测。目前，硒的形态分离主要依靠色谱技术，如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC) 、离子色谱(IC)、毛细管电泳技术(CE)等，检测技术则有电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子吸收光谱(AAS)、原子发射光谱(AES)等。目前，色谱分离与光谱分析仪器联用技术被广泛应用于硒的形态分析[41]，如高效液相色谱—氢化物发生—原子荧光联用技术(HPLC-HG-AFS)、气相色谱—电感耦合等离子体质谱联用技术(GC-ICP-MS) 等。其中高效液相色谱—电感耦合等离子体质谱联用技术(HPLC-ICP-MS) 因其检出限低、灵敏度高、选择性好、稳定性强等诸多显著性优点而被广泛应用于硒形态分析研究。

3 结论

样品前处理是保证分析准确性的关键步骤，植物样品基质复杂，其中的硒形态种类多、易转化，需要根据植物样本及硒形态特点、检测方法的需求采取恰当的前处理方式。目前，液相萃取法是硒形态分析中传统的前处理技术，其中超声波辅助蛋白酶提取法效率最高、应用最为广泛，加压液体萃取法提取快、消耗溶剂少，具有良好的发展前景。近年来，液相微萃取、固相微萃取等微型化样品前处理技术因具有操作简单、环境友好等优点，逐渐被应用于植物样品中硒形态的研究。高效分离技术与灵敏的检测技术相结合是当前硒形态分析技术的主流，随着联用分析技术的发展，硒形态的分析更加快速而准确。未来硒形态分析将向着提取分离检测一体化、连续化、自动化、绿色化、超痕量方向发展，这也将促使植物样品硒的前处理技术在微型化、简便性、高效性等方面进一步发展。