甲型流感病毒基质蛋白M1的研究进展

孙艺学，丛彦龙

(1.长春大学 吉林省生物医学工程研发中心，吉林 长春 130022；2.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)属于正黏病毒科、α流感病毒属，是感染各种鸟类和多种哺乳动物的病原体。IAV基因组由8条分节段的、单股负链RNA组成，编码至少17种蛋白[1]。其中，基质蛋白1(matrix protein 1，M1)是IAV第7基因节段所编码、294个氨基酸组成，且是病毒粒子内含量最高的结构蛋白，约占病毒蛋白总量的40%[2]。每个病毒粒子约含有3 000个M1分子[3]，紧挨在病毒囊膜下层形成一层基质。但M1并不是孤立存在的，其向外与IAV的两种跨膜纤突蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的胞质尾区结合[4]，向内与病毒的8个核糖核蛋白(viral ribonucleoprotein，vRNP)互作[5]。M1不仅保持了病毒粒子的完整性，维持并调节病毒粒子的形态，而且在病毒生命周期的不同阶段发挥着多种功能[6-7]。

1 M1的结构

在负染电镜下，M1是长约60Å的杆状物，其与病毒囊膜接触，但没有嵌入膜内[8]。高分辨率冷冻电子断层扫描显微镜显示，M1为空心圆柱体，类似一串螺旋盘升的“珠子”[9]。X射线分析显示，约90%的M1的二级结构由α-螺旋组成，具体包括3个结构域，即由4个α-螺旋(H1～H4)构成的氨基端结构域(残基1～66)，由4个α-螺旋(H6～H9)构成的中间结构域(残基88～158)，以及预测的同样由4个α-螺旋(H10～H13)构成的羧基端结构域(残基167～252)。其中，氨基端结构域和中间结构域位于M1的N-末端，二者由L4-H5-L5连接，即所谓的“连接区”(残基67～87)[2]。中间结构域和位于C-末端的羧基端结构域由一个环区L9(残基162～166)连接，其间保守的163RQMV166基序具有Q-M裂解位点[10]。

2 M1在IAV复制周期中的功能

M1合成于IAV感染的晚期，在病毒生命周期中的脱壳、vRNP出核、病毒组装和出芽等多个阶段均发挥作用。

2.1 介导vRNP的释放IAV进入细胞后需要将vRNP释放到细胞质以开启病毒的复制周期，而拆除基质层M1的骨架结构(即病毒的脱壳)是vRNP释放的前提条件。三维结构分析表明，IAV的8段vRNP的排列方式是基于M1骨架结构的支撑[11]，但这种支撑作用在病毒复制周期中的不同阶段时有时无。在pH6.0左右时，基质层的构象开始发生变化，使M1与vRNP的互作弱化，导致病毒粒子的刚性丧失[12]，此时是病毒脱壳的启动阶段。当pH值下降至4.9时，M1骨架解体，不再靠近病毒囊膜，此时vRNP出现非对称性定位，M1与vRNP形成一个聚集体，并促使vRNP进入细胞质[9]。由此可见，M1与vRNP的互作与pH的改变有关。进一步研究发现，在pH 6.5～7.0和5.0～5.5时，M1的电荷数明显不同，由此导致病毒的结构发生明显变化[13]。

2.2 介导新组装的vRNP出核研究发现，当M1的合成受阻时，vRNP的出核将受到抑制[14]，表明M1是子代vRNP出核的必需蛋白，同时也暗示新合成的M1需要入核才能帮助vRNP出核。研究显示，在M1的多功能基序(残基91～105)中，有富含碱性氨基酸的经典核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，位于残基101RKLKR105。在空间构象上，NLS位于M1的N-末端结构的表面，在α-螺旋H6和H7之间形成一个暴露的环。NLS是M1入核的关键因素，缺失NLS的M1不能入核[15]。新合成的M1在入核后，位于M1转录抑制区中的残基R/K95、K98和K102可以与vRNP互作[16]，调节vRNP中RNA聚合酶的活性，从而适时阻止vRNA的转录，以利于vRNP的顺利出核。但是，新合成的M1并非全部入核，留在细胞质中的部分M1能够阻止已经出核的vRNP再次入核[14]。

2.3 介导病毒的装配和出芽M1被称为IAV组装的“适配器”。作为枢纽，M1通过与病毒的其他蛋白协同作用以诱导细胞质膜弯曲，再通过与NP的互作将vRNP整合到出芽部位。M1与细胞质膜结合和M1的寡聚化是病毒粒子组装过程中两个密切相关的过程。当M1单体(或二聚体)与质膜结合后，会触发M1在质膜下重排形成螺旋状的寡聚体，并暴露出另一侧以便与未结合的M1分子互作[9]。结合到质膜上的M1通过与HA、NA和/或M2的胞质尾区互作，从而诱导质膜弯曲，此即病毒的出芽位置。作为招募vRNP的停靠点，与质膜结合的M1通过其C-末端与vRNP中的NP蛋白结合，由此将vRNP运送至质膜处。在此，vRNP被选择性地装配到出芽的病毒粒子中[17]。

3 M1对IAV生物学表型的影响

3.1 维持病毒形态M1在出芽病毒粒子的囊膜下形成一层基质，为病毒囊膜提供刚性支撑。多项研究表明，M1是维持和调节IAV形态表型的决定性遗传因素[18]。例如，将以丝状表型为主的2009年新甲型H1N1流感病毒的M1基因替换到A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(PR8)中，可以使PR8由球形变为丝状[19]。此外，M1的氨基酸残基突变也可以影响病毒粒子的形态表型。例如，N30D和T215A突变会使A/Duck/Guangxi/53/2002(H5N1)由球状变为丝状。K102A突变的A/WSN/1933(H1N1)(WSN)可以形成丝状粒子，而K95A、K98A、R101A、K102A的协同突变则可使WSN的形状和大小各异，并且其形态表型会随温度改变[20]。R95K和E204D突变会降低A/Udorn/307/1972(H3N2)的丝状表型[21]。将PR8经豚鼠反复传代后，它的M1逐渐出现87，92，101，157等位点的累积突变，最终使PR8由球形变为丝状[22]。但是，某些M1位点变异会导致病毒粒子出芽异常，由此释放出更长的病毒粒子[23]。进一步研究发现，在IAV组装时，不同的M1螺旋转角也会影响病毒的形态[9]。

3.2 影响病毒的复制研究显示，M1能够通过自身的代偿性突变修复基因缺失病毒的复制力。例如，缺失NS1的WSN经过连续传代后发生M1/A14U变异，尽管M1的mRNA水平受到影响，但是病毒的其他蛋白表达水平均不受影响。NINPAN等[24]研究发现，A/ostrich/Zimbabwe/222-E3/1996(H7N1)的NP蛋白在A549细胞中存在出核缺陷，但是NP的297位和M1的227位在传至第10代的协同突变可以挽救病毒的复制缺陷。此外，M1的翻译后修饰也影响病毒的复制。研究发现，M1/242K的SUMO化在M1-vRNP复合体形成，vRNP出核、转运、装配，以及病毒的出芽过程中均发挥重要作用。当M1发生K242E突变时，M1与vRNP的结合能力降低，影响M1-vRNP复合体的形成和vRNP的出核，从而阻碍病毒的复制[25]。M1还可以发生磷酸化修饰。M1的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基可以被蛋白激酶C和细胞外信号调节蛋白激酶磷酸化[26]。磷酸化位点在M1入核和病毒复制中的作用至关重要。去除M1第132位的磷酸化，会损害M1与importin-α1的结合，从而因M1的入核受阻导致病毒的复制力下降[27]。

3.3 影响病毒的毒力M1是IAV毒力的基础。例如，A/Port Chalmers/1/73、A/FPV/34、PR8和WSN在适应小鼠的过程中，M1的A41V突变能够增强病毒对小鼠的致病力。FAN等[28]发现，2株鸭源H5N1病毒均能致死鸡，但只有1株对小鼠具有致病力。究其原因，发现M1的30和215位是影响H5N1病毒毒力的重要氨基酸位点。

3.4 影响病毒的传播能力M1影响病毒传播能力的证据基于2009年新甲型H1N1流感病毒。当将A/California/4/2009的M1基因替换到PR8时，能够恢复PR8在豚鼠的传播能力。二者的差别在于PR8的M1第41位编码V，而A/California/4/2009的M1编码A[19]。后经研究发现，M1/41位是IAV有效传播的重要位点[29]。由于M1/41位不仅影响病毒的形态，还与传播能力有关，据此推测病毒的形态与其传播能力有关。一般认为，天然的丝状表型更有利于病毒的传播[30]。

4 小结与展望

作为一种多功能蛋白质，M1在病毒复制过程中发挥着重要作用。与暴露在IAV表面的两种糖蛋白HA和NA相比，IAV的内部蛋白进化速度较慢，其中M1是进化最慢的蛋白之一。对全球不同物种来源的、不同亚型IAV的序列分析显示，M1氨基酸的序列一致性超过95%[31]。较低的变异频率可能是由于M1受到的选择压力强度较低，因此没有必要经常“变脸”。而更可能的原因是，M1的多功能角色使其对变异做出了自我约束，当然也可能是因为其自身承受不了过多的突变。此外，M1残基的低突变耐受性也反映了其位点在病毒感染周期中的重要作用。作为丰度最高的IAV蛋白，M1的低突变耐受性暗示它在维持病毒结构与功能方面所发挥的作用不容小觑。从M1蛋白的适应性着手，开展以M1各个变异表型功能为导向的分子基础研究，有望成为解析IAV物种适应性差异和流行优势更迭的切入点。

此外，序列的高度保守性使M1成为一个理想的广谱抗病毒靶点。据推测，通过一个小分子“楔形物”与M1-M1界面紧密结合，以此破坏M1的寡聚化，将产生一类全新的抗流感药物。为了证明其可行性，KORDYUKOVA等[13]对一个超过70 000种的商用小分子库进行了虚拟筛选，结果发现了有进一步研究价值的M1的“楔形物”抑制剂。生物物理学研究表明，一些抑制剂确实能够通过与M1结合，由此削弱M1-M1的自缔合作用，进而降低了成熟病毒粒子中基质层的厚度，导致季节性H1N1、大流行性H1N1、H3N2和H5N1等多株流感病毒在鸡胚中的复制受到抑制。因此，M1有望成为一个全新的抗流感广谱药物的理想靶点。