基于外泌体miRNA 靶向诊疗结直肠癌的研究进展

王玉婷 王安琪 李志利 吕政融 黄楚月 樊志敏

南京中医药大学附属南京中医院肛肠科，江苏南京 210000

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居世界范围内第3 位，且病死率处于第2位[1]。当前，CRC 的诊疗方面主要存在两大困境。首先，早期诊断筛查常用的生物标志物，例如癌胚抗原、糖类抗原19-9 等，存在特异性以及敏感性不足的问题[2-4]。其次，耐药性常限制靶向化疗药物的疗效。因此，寻找可以有效靶向诊疗CRC 的方式是亟待解决的问题。近年来，不断有研究指出循环中的外泌体分泌的一些微小RNA（microRNA，miRNA）与CRC 密切相关，它们不仅可以作为生物标志物，早期特异性提示肿瘤的增殖与分化，还可以成为创新性靶点，为CRC 的治疗提供更广泛的思路[5-7]。基于以上背景，本文梳理了循环中外泌体及其分泌的miRNA 的生物学特征，并分别阐释了外泌体miRNA 诊断与治疗CRC 的潜在方式与相关通路，以期建立基于外泌体miRNA 诊疗CRC 的创新模式。

1 外泌体miRNA 的生物学特征

外泌体是直径30～100 nm 具有介导细胞间通信功能的内源性小囊泡，它广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液及乳汁等多种体液中，且常携带着蛋白质、脱氧核糖核酸、核糖核酸、脂质等活性物质[8-9]。其中，miRNA 的功能最为广泛且具有功效强、稳定性高等特点，因此现代研究较深入地探讨了其生物学特性及作用机制。

首先，在生理学特性方面，miRNA 是一种21～22 nt的小非编码RNA，通过与靶mRNA 的互补3’-非翻译区结合而发挥转录后基因调控作用[10]。其次，在功能特征方面，miRNA 可以影响包括细胞周期检查点、细胞增殖和凋亡在内的多种通路，并通过影响肿瘤微环境的稳态调节癌症的发生与发展，例如：姜黄素诱导的miR-192-5p 上调，可以通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信号通路，进而影响人非小细胞肺癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡[11]。后续的研究表明[12]，CRC 患者循环miR-192-5p 含量下调还会诱导肿瘤细胞内血管增生，引起肿瘤内环境紊乱，最终增加CRC 淋巴转移及血管侵袭的风险。基于以上特性，外泌体miRNA 可以从细胞代谢及肿瘤微环境等方面影响癌症的发生与发展，同时结合其功效强、稳定性高的特点，外泌体miRNA 有望成为CRC 等癌症诊断的关键生物标志物以及创新性的治疗靶点。

2 外泌体miRNA 作为CRC 潜在的临床生物标志物

首先，在生物标志物方面，外泌体miRNA 不仅参与CRC 的检测与诊断，还可作为判断预后的标志物，为优化CRC 治疗方案提供切实可靠的客观依据。

2.1 外泌体miRNA 作为CRC 的诊断生物标志物

在早期CRC 阶段，循环中外泌体miRNA 的含量波动可能对CRC 的早期诊断具有重要的指示作用。常文婧等[13]在提取40 名健康受试者与78 例CRC 患者的血清并分析后指出，CRC 患者较对照组血清外泌体miR-218-5p 的表达明显降低，这提示miR-218-5p具有成为CRC 诊断标志物的潜力。另一项通过检索TCGA-COAD 数据库获得的miR-27a 表达谱显示，过表达miR-27a 的CRC 细胞增殖、侵袭和迁移能力增加，这项研究支持miR-27a 作为CRC 的诊断标志物[14]。此外，大量研究证实包括miR-130a[15]、miR-21[16]、miR-29[17]、miR-125a-3p[18]等在内的多种循环外泌体miRNA 均可以作为CRC 的诊断标志物。其中，CRC疾病进程中常过度表达的原癌基因miR-21 潜在的临床意义更受认可，下文将着重阐释。

由于miR-21 具有高度的敏感性和特异性[19]，其含量的变化不仅可以用于CRC 的早期筛查诊断，还可以灵敏地反映出CRC 的分期[20]。首先，在CRC 早期筛查诊断方面，一项随机临床试验指出，息肉和CRC患者血清miR-21 的表达显著升高[21]，后续研究发现过度表达的miR-21 可以通过调控磷酸酶和张力蛋白同系物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）/PI3K/Akt 信号通路，下调大肠癌中PTEN 的表达，进而影响细胞增殖、血管生成、肿瘤细胞迁移和凋亡等生物学过程。其次，在反映CRC 分期方面，能够显著区分大肠癌Ⅲ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期[22]。

结合上述研究可得，外泌体miRNA 有望成为诊断CRC 的关键生物标志物。但由于miRNA 种类的广泛性及靶点的非特异性，其反映CRC 的敏感性尚存疑问。事实上，相关研究已指出外泌体miRNA 常由于多种非靶点效应干扰对疾病的诊断及治疗[23]。因此，后续研究应聚焦外泌体miRNA 的关键性、特异性功能，以推动其临床应用进程。

2.2 外泌体miRNA 作为CRC 的预后生物标志物

除了作为CRC 的诊断标志物，外泌体miRNA 与淋巴转移、远端转移和术后复发等临床病理学特征相关，因此它还可作为CRC 患者的预后标志物。临床研究表明，CRC Ⅴ期患者血清miR-200c 水平的显著升高与淋巴结转移、血管侵袭等预后不良指标呈正相关[24]。同样，Cho等[25]通过qRT-PCR 检测了69 例CRC 患者血浆中的外泌体也证实了血清外泌体miR-193a 显著减少，及let-7g 含量增加，与CRC 静脉浸润和淋巴浸润等不良预后指标关联显著，并不同程度地降低了患者的存活率。而从机制上分析，外泌体miRNA 含量异常的变化常通过调节癌细胞的代谢，影响相关疾病的进程，例如，Sun等[26]发现源自转移性CRC 细胞系（SW620）的外泌体miR-335-5p 通过其靶基因RASA1 激活RAS 信号传导，最终促进CRC 细胞侵袭、转移和上皮间质转化。因此，外泌体miR-193a、let-7g及miR-335-5p 等有潜力成为判断CRC 预后的生物标志物，并为CRC 的临床治疗提供有价值的前沿策略。但是目前如何将复杂的miRNA 变化与患者个体情况交叉对应，并据此制订更加精准的个体化治疗方案是亟待解决的问题之一。

3 外泌体miRNA 在靶向治疗CRC 中的应用

外泌体miRNA 靶向治疗CRC 主要体现在改善CRC 患者化疗耐药性以及通过“外泌体-miRNA”递送系统传递功能性miRNA。首先，CRC 患者长期治疗过程中会普遍存在化疗耐药现象，影响患者的生活质量及预后情况。有研究指出[23]，外泌体miRNA 可以调控许多药物反应中的关键功能蛋白，从而改善CRC 患者的化疗耐药性。此外，一些外泌体可以协助miRNA逃避宿主的免疫检测，有效传递具有抑癌或改善化疗耐药性功能的miRNA，这一“外泌体-miRNA”递送系统也拥有良好的临床应用前景。

3.1 外泌体miRNA 改善CRC 化疗耐药

许多临床常用的化疗药物靶向调节细胞周期及诱导细胞凋亡等方式抑制CRC 的进展。然而，患者对以氟尿嘧啶、奥沙利铂为例的化疗药物的耐药性是导致化疗失败的原因之一。研究表明[27]，外泌体miRNA可有效改善患者对化疗药物的耐药性。Jin等[28]在奥沙利铂/氟尿嘧啶耐药的CRC 细胞系模型中检测了多种与CRC 进展密切相关的miRNA 表达水平，发现模型中外泌体miR-21-5p、miR-96-5p、miR-1246 和miR-1229-5p 的表达明显高于对照组。后续经过富集信号通路发现，上述外泌体miRNA 参与了在细胞生长、代谢和化疗耐药发挥生物学作用的PI3K/Akt 信号通路。通过靶向抑制上述miRNA 的表达可以促进CRC细胞对奥沙利铂/ 氟尿嘧啶的敏感性，从而为改善CRC 化疗过程中的耐药现象提供新的靶点。Liu等[29]使用编码miR-128-3p 的慢病毒质粒转染耐奥沙利铂的CRC 细胞结果表明，外泌体miR-128-3p 增强了CRC 细胞对奥沙利铂的敏感性，并显著抑制了肿瘤的生长。这一方面是由于miR-128-3p 可上调E-钙黏素水平，并通过抑制耐药细胞中Bmi1 基因的表达来抑制奥沙利铂诱导的上皮-间充质转化。另一方面，它还通过抑制药物转运体MRP5 的表达而增加奥沙利铂在体内的蓄积时间。因此，外泌体miRNA 可以通过多靶点多通路的方式作用于化疗药物反应中的关键蛋白，改善患者对化疗药物的耐药性。基于这一特性，靶向调节外泌体miRNA 作为化疗辅助方式可以成为创新性的CRC 治疗方式。

3.2 外泌体-miRNA 运载体系

外泌体作为细胞间信息的天然载体，参与细胞间生物分子的交换，且其可以通过膜上的“配体-受体”识别并将miRNA 运送到特定类型的细胞，协助miRNA 躲过宿主免疫识别，特异性发挥相关疗效。此外，与脂质体、树突状细胞和聚合物等合成纳米制剂比较，外泌体还具有体积小、生物相容性好、毒性低的优点，更适合作为特定miRNA 的递送载体[30-31]。

上文已经介绍miR-21 是一种原癌基因，使用miR-21 抑制剂是治疗CRC 的有效方式之一，但是由于宿主免疫识别，miR-21 特定的抑制剂往往效能低下。2020 年，Liang等[32]创新性地将携带氟尿嘧啶和miR-21 抑制剂寡核苷酸的外泌体导入耐氟尿嘧啶的大肠癌细胞及荷瘤小鼠体内后，发现耐药细胞对氟尿嘧啶的摄取增加，且其内miR-21 的表达显著下调，最终明显抑制了荷瘤小鼠体内的肿瘤生长。此研究直观证明了“外泌体-miRNA”递送系统可以有效提高癌症的治疗效率。Han等[33]则将抗miR-221 寡核苷酸导入外泌体中，再添加到HCT116 细胞中培养后发现CRC 细胞增殖受到了明显抑制。随后其在皮下HCT116荷瘤小鼠中继续使用抗miR-221 寡核苷酸-外泌体治疗验证后发现治疗小鼠的肿瘤体积增长明显慢于对照组。因此，外泌体-miRNA 运载体系靶向治疗CRC 效果显著，有望成为治疗CRC 及改善肿瘤耐药的新兴疗法。然而，“外泌体-miRNA”递送系统导入的外源性miRNA 是否会引起宿主原有游离miRNA 种群的波动仍未可知。同时，外源性miRNA 与游离miRNA之间的动态关系还可能会加剧CRC 微环境的复杂性。因此，基于“外泌体-miRNA”递送系统的治疗模式尚存空白，后续研究应注重探讨外源性刺激与内环境稳态之间的动态平衡。

4 小结

越来越多的证据表明，外泌体miRNA 与CRC 的发生、发展、转移、凋亡等过程密切相关，因此可能作为CRC 诊断、评估预后的生物标志物及治疗靶点[6，34]。在此基础上，本文综述了外泌体miRNA 作为诊断并判断CRC 临床分期及其预后生物标志物的潜力，并为CRC 治疗提供了相关优化方案，以期在临床早日普及基于外泌体miRNA 的CRC 诊疗模式。虽然目前大量关于外泌体miRNA 诊疗CRC 的实验研究都表明了其临床可行性[35-36]，但仍有必要进行一些大型的前瞻性研究，以探索最佳的敏感性和特异性。此外，优化外源性miRNA 与体内游离miRNA 之间的动态平衡也应成为临床治疗原则之一。