类器官培养技术在呼吸系统疾病中的应用*

李晓娜， 齐先梅， 张田甜， 王婧

类器官培养技术在呼吸系统疾病中的应用*

李晓娜， 齐先梅， 张田甜， 王婧△

（中国医学科科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院，北京 100010）

类器官；呼吸系统疾病；干细胞

呼吸系统主要负责人体与外界的气体交换，包括上呼吸道和下呼吸道。上呼吸道由鼻、咽和喉组成，下呼吸道从近端到远端由气管、支气管、细支气管和肺泡组成。气管和支气管由假复层纤毛柱状上皮、基底细胞、杯状细胞和棒状细胞组成；细支气管除了上述细胞外，还有肺神经内分泌细胞；肺泡则主要由肺泡I型上皮细胞（alveolar type I cells， AT1）和肺泡II型上皮细胞（alveolar type II cells， AT2）组成。AT1扁而宽大，参与构成气-血屏障；AT2为立方形或圆形，主要功能为分泌表面活性物质，降低肺泡表面张力，维持肺泡形态。呼吸系统的病变会导致多种临床症状：咳嗽、气喘、呼吸困难、呼吸衰竭、胸痛等，给患者带来严重负担。

类器官，又称3D组织培养物，是由体外干细胞生长而成的三维组织衍生物，具有特定器官的多种关键细胞类型和相似的组织结构，可以重现该器官的功能。更多的数据证明，相比传统的2D细胞培养模式，3D细胞培养更能模拟体内的组织情况，在结构和细胞信号传导方面都与体内情况更加相似，在作为疾病模型进行分子机制研究和药物分析、甚至发展再生器官移植方面都有着巨大的潜力［1］。类器官的概念最早在1946年提出，用于描述囊性畸胎瘤［2］。2009年，Sato等［3］利用Lgr5+上皮细胞培养出无间质隐窝-绒毛结构类器官，此后，这一技术飞速发展，建立了多种肠道疾病模型，例如肠癌、小肠囊性纤维化、小肠感染性疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎等，为相应的疾病研究提供了坚实的基础。

在这篇综述中，我们将对近年来类器官的发展及其在肺癌、肺纤维化和肺部感染性疾病的研究进展做出总结，为今后类器官在呼吸系统疾病中的应用提供理论依据。

1 肺类器官的发展历程

2012年，Wong等［4］第一次描述了使用气液界面培养的方法，由诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells， iPSCs）培养出肺类器官。2015年，Dye等［5］报道了由人类多能干细胞（human pluripotent stem cells， hPSCs），包括胚胎多能干细胞（embryonic pluripotent stem cells， ESCs）和iPSC，培养出了人肺类器官（human lung organoids， HLOs），在培养过程中干细胞经历了内胚层-前肠内胚层-腹侧前前肠球体各个阶段。它的组织结构与肺类似，拥有近端气道的结构和远端气道的上皮结构，包括气道样上皮、基底细胞、未成熟的纤毛细胞、包裹上皮细胞的肌成纤维细胞和平滑肌细胞，还有未成熟的肺泡样区域，类似于胎儿肺，可用于研究肺发育及作为疾病模型。2017年，Tan等［6］第一次尝试以成人来源的细胞培养类器官，该研究证明，将成人的支气管上皮细胞、肺成纤维细胞和肺微血管内皮细胞放置在恰当的三维组织培养环境中，细胞将迅速自排列成为离散的上皮和内皮结构，且在结构与功能上具有稳定性。2019年，Miller等［7］通过将hPSCs进行3个阶段的培养，获得了肺芽类器官与肺类器官。2020年，Salahudeen等［8］通过人肺组织获得成体干细胞，培养出了肺类器官。

2 肺类器官的培养方法

类器官的细胞来源有两个方面，一是多能干细胞，包括ESCs以及iPSCs，通过添加不同的细胞培养基、基质胶、细胞因子、小分子化合物诱导其向特定器官的方向进行分化，经各个发育阶段后分化为各种细胞；二是成体干细胞，包括基底细胞、分泌细胞和AT2。从组织活检或手术切除的标本中取出部分组织，在相应环境下直接培养，使其生长为与其来源类似的组织结构，该方法培养的类器官与干细胞来源类器官的形态和功能相似。

2.1胚胎干细胞来源肺类器官的培养方法由胚胎干细胞培养得到肺类器官需要3个阶段。第一阶段hPSCs经Activan A培养4 d后向内胚层分化；第二阶段改用Noggin、SB431542、SMO激动剂、FGF4和CHIR99021处理3 d，前肠形成前肠球体；第三阶段将球状的前肠球体分离至两种不同条件的基质胶滴，即将基质胶滴在培养皿形成的半球结构状培养基中培养，分别形成肺类器官与肺芽类器官。前肠球体在添加FBS与FGF10的基质胶中培养得到肺类器官，其具有气道样结构、周围间质和肺泡祖细胞。前肠球体在添加FGF7、ATRA、CHIR99021和Step 20B的基质胶中培养得到肺芽尖类器官，针穿处理得到均质的肺芽尖端祖细胞，未针穿处理得到具有远端-近端之分的肺芽状结构［7］。

2.2成体干细胞来源肺类器官的培养方法机械分离距离脏胸膜1 cm处的人肺组织，用猪弹性蛋白酶，脱氧核糖核酸酶和Normocin洗涤孵育，得到成体干细胞，在添加-乙酰半胱氨酸、1× B27、NOGGIN（BMP拮抗剂）、EGF和TGF-β抑制剂A83-01的DMEM/F12培养基中培养，经搅拌、过滤、裂解红细胞等步骤后，用10倍体积的降生长因子基底膜提取物Ⅱ重悬，将混悬液以50 μL液滴置于24孔板。单细胞测序显示培养出的细胞包括SFTPC+的AT2细胞、KRT5+的基底细胞、SCGB1A1+的Club细胞。以初始细胞分裂率计算，培养的基底肺类器官扩张上限为219（524 288倍），肺泡扩张上限为216（65 536倍）［8］。Zhang等［9］分离小鼠原代肺泡细胞，使用SV40大T抗原的逆转录病毒进行处理，产生非致瘤性且保持长期活性的肺泡细胞，进一步筛选AT2亚群，建立肺类器官，证明其能具有AT2细胞特性，可用于建模肺部疾病。

3 类器官在呼吸系统疾病中的应用

由于类器官具有多种细胞类型及部分组织结构，它被广泛的应用于各类疾病的研究。而在呼吸系统中，主要应用于肺癌、肺部感染性疾病、肺纤维化疾病中。肺类器官用于呼吸系统疾病的机制及药物筛选的相关研究，对进一步对这些疾病有更深刻的认识，提供了有力的支撑。

3.1类器官在肺癌中的应用肺癌是最常见的癌症，也是男性癌症的主要原因，肺癌有多种类型，突变模式也多种多样，这使得肺癌的研究与治疗具有很大的难度。目前，在癌症研究领域应用的体外疾病模型主要有2D细胞培养癌细胞株、人源肿瘤异种移植模型（patient-derived tumor xenograft， PDXs）和肿瘤类器官（patient-derived organoids， PDOs）。癌细胞株具有操作简单、成本较低的优点，但由于其采用细胞二维培养的方式，使得肺癌的异质性这一复杂特征得不到体现。PDXs是通过将患者肿瘤移植到免疫缺陷小鼠中得到的，在组织结构上对原发性癌症有着很大程度的还原，但由于其成本高昂、建模周期长且成功率不高而有所限制。目前，类器官已投入到多种癌症的研究中，包括胃肠癌［10］、膀胱癌［11］、乳腺癌［12］等。PDOs是将患者癌组织培养成相应的组织团块，与PDXs相比有它不可替代的优势：即建模成功率更高、建模时间更快以及成本更低。Weeber等［13］研究证实，PDOs在至少大块癌症组织的DNA水平上表现出原发肿瘤的特点；Sato等［14］发现，PDOs除了构建时间较短外，在长时间的扩张下依然能保持遗传和形态上的稳定。这些发现为肿瘤类器官的应用提供了可靠的依据。Kim等［15］通过开发一种由于缺乏Wnt3a和Noggin而抑制正常细胞生长的基本培养基，创建了80个肺癌类器官样本库，包括5种肺癌亚型（腺癌、鳞癌、小细胞癌、腺鳞癌和大细胞癌）。这些肺癌类器官（lung cancer organoids， LCOs）维持着亲本癌组织的遗传特征，在HE染色与免疫组化分析中表现出与亲本癌组织相似的形态及组织结构，也能够表达对应各自组织类型的肿瘤标志物，且形态学在培养长达超过6个月的情况下都没有发生任何变化，进一步采用小的活检组织也得到了相应的LCOs，证明临床样本也可以培养产生类器官。此外，将23个患者的上皮细胞样本同时进行2D细胞培养PDXs与LCOs，结果显示2D细胞培养成功率最高（100%），LCOs培养的成功率（87%）高于PDXs（3%），但LCOs培养所需时间（4周），明显短于PDXs（3～6月），总的来说，从建模成功率、建模时间、建模成本三个方面，肺类器官优势明显［15］。不仅如此，将PDOs移植到免疫缺陷小鼠体内时，依然能够成功构建PDXs。

此外，除了肺癌造模方面的优势，肺类器官在肺癌的机制研究中也做出了相应的贡献：Lazarus等［16］开发了一种敲除基因的基底细胞的肺类器官，并且证明了是一种鳞癌基因。在药物研究方面，具有人体生理结构，并且可由患者组织直接培养的肺类器官具有筛选治疗药物的作用［17］。源于患者的肺类器官可以作为药物高通量筛选或个体化用药的药物效果检测手段［18］。肺类器官与其他新技术的结合也使研究方法更为多样化：Hai等［19］使用CRISPR-Cas9技术对小鼠来源的肺类器官进行基因重编辑，删除多个肿瘤抑制基因，通过与患者来源的细胞系进行比较，发现其在基因与表型水平上与人类肺鳞状细胞癌相接近，并以此模型阐明免疫检查点阻断与DNA损伤诱导疗法治疗人类肺鳞状细胞癌的假说。

相比2D细胞与PDXs，PDOs无疑是更为理想的癌症模型，但是在指导临床决策方面依然面临挑战。第一，PDOs与肿瘤的一致性目前尚无法确认是主克隆还是亚克隆，难以避免肿瘤异质性的问题，对治疗的准确性有所影响。第二，PDOs的技术难度相对较高且技术相对不成熟，前期投入成本较高，难以普遍投入研究，对治疗的广泛性有所影响。因此，细化PDOs中肿瘤发生过程、降低前期相应研究成本则是PDOs所面临的挑战。

3.2类器官在肺部感染性疾病中的应用肺部感染性疾病即肺炎，由病原体感染导致，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫，常导致发热、咳嗽和咳痰等临床症状，部分病原体还可通过呼吸道飞沫传播，造成不同程度的流行，对公共卫生安全造成威胁。我们对近年来肺类器官在肺部感染性疾病中的研究进行总结，包括新型冠状病毒、呼吸道合胞病毒、隐孢子虫和肠道71型病毒等导致的肺炎。

3.2.1新型冠状病毒病（coronavirus disease 2019， COVID-19）为了研究COVID-19的发病机制，Han等［20］利用hPSCs培养出包括AT1、AT2、基质细胞、增殖细胞、少量神经内分泌细胞及气道上皮细胞的类器官，接种严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-COV-2）24 h后，在感染的肺类器官中检测到大量复制的病毒RNA，证实用肺类器官可建立COVID-19疾病模型。此外，SARS-COV-2感染的肺类器官基因集富集分析发现IL-17的信号通路发生改变，且可诱导多种趋化因子包括CXCL2、CCL2、CXCL3等上调，这些结果都与COVID-19患者肺组织发生的分子改变一致［20］。Salahudeen等［8］培养了一种来源于成人AT2或Krt5+基底层细胞的远端肺类器官，对基底层来源的类器官进行单细胞测序后发现，有一部分ITGA6+、ITGB4+有丝分裂的细胞，其中TNFRSF12Ahi的部分展现出丰富的克隆活性，这为培养远端肺类器官的来源细胞有指导意义。接着他们制作了尖端外极性的类器官，即将SARS-COV-2的作用靶点血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2， ACE2）暴露于外表面，对SARS-COV-2的感染有了更准确的研究，结果发现，Club细胞在COVID-19中是重要的作用靶点。同样的，Pei等［21］使用人的ESCs来源的肺类器官发现其能够支持SARS-COV-2完成完整的感染与传播，SARS-COV-2能够感染它的纤毛细胞、棒状细胞和AT2。在COVID-19的治疗方面，Han等［20］利用类器官建立的COVID-19疾病模型对化学分子进行高通量筛选，确定了2种美国食品药品监督管理局批准的治疗COVID-19的候选药物：伊马替尼和麦考酚酸。接着，Han等［22］又通过使用hPSCs建立了SARS-COV-2易感的肺及肠的相应类器官，通过对美国食品药品监督管理局批准的相应药品进行高通量筛选，进一步确定了伊马替尼、霉酚酸和盐酸阿那平可以作为SARS-COV-2的抑制剂。Samuel等［23］则通过培养人类胚胎干细胞来源的肺类器官，证明抗雄激素药物可以减少ACE2的表达，降低男性对SARS-COV-2的易感性。在COVID-19的相关研究中，类器官不仅在建模方面提供了可靠的方式，避免了物种差异引起的研究偏差，也通过高通量筛选的方式在治疗中提供了积极的提示。

3.2.2呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）感染RSV是多见于新生儿及6个月以下婴儿下呼吸道感染的RNA病毒，以飞沫和密切接触传播，主要靶点为假复层纤毛上皮细胞，造成下呼吸道上皮细胞的肿胀、脱落并因此阻塞小气道，造成细支气管炎及肺炎，导致呼吸困难。临床上，这种疾病尚缺特效的治疗方法［24］。目前没有可供研究RSV感染的疾病模型，而肺类器官经历了肺发育中的各个阶段，更接近发育中的肺，对儿童呼吸道感染疾病的研究而言是更好的病理生理研究模型。Chen等［25］通过建立肺芽类器官，观察呼吸道合胞病毒对类器官的感染是否具有人体感染的特征，研究显示，RSV会造成肺芽类器官气道上皮细胞的肿胀及脱落，这与先前在人类气道上皮细胞系研究以及病理标本中的表现一致，证明了以肺芽类器官作为载体研究呼吸道合胞病毒的可行性。Porotto等［26］使用RSV感染源自hPSCs的肺类器官，同样发现受感染细胞脱落进入肺腔；当感染副流感病毒后，全基因组测序表明病毒基因不会出现其他模型中发生的改变，核苷酸一致性不会由于选择压力而发生改变，进一步证实模型的特异性。然而以肺类器官探索RSV的机制以及治疗方面还有待深入的研究。在RSV的相关研究中，肺类器官在建立可靠的研究模型上提供了重要的方式，接近发育肺的状态更符合其感染模式，为后续的机制探究提供了可能。

3.2.3隐孢子虫感染隐孢子虫病是一种人兽共患寄生虫病，感染呼吸道表现为剧烈呼吸道症状。对免疫力低下的人群老人，幼儿，孕妇甚至有着致命的威胁，1986年被世界卫生组织定为怀疑艾滋病的指标之一。然而，目前所存在的体外寄生虫-病原体相互作用系统由于可培养时间较短，难以完整的模拟隐孢子虫在人体内的感染周期，使研究其病理生理机制遇到阻碍。类器官由于其可在体外培养时间较长，能够作为寄生虫感染方面的疾病模型。Heo等［27］发现隐孢子虫可以感染肠道和肺类器官，证明隐孢子虫主要作用于分化的小肠细胞，将隐孢子虫的感染阶段卵囊微注射入类器官，免疫荧光共染和透射电子显微镜显示其在小肠类器官中可以完成有性及无性生殖阶段；在类器官中生命周期所形成的卵囊也被证明具有与动物来源相似的感染能力。无独有偶，Dutta等［28］开发了隐孢子虫感染至肺类器官中的方法，用微注射使得隐孢子虫在可以在体外实验中成功完成整个生命周期，这使得肺部寄生虫病的研究在寻找合适的体外疾病模型上取得了进步。与呼吸道胞病毒相同，以肺类器官探索隐孢子虫感染的相关机制及治疗还有待进一步探索。在隐孢子虫感染的相关研究中，肺类器官能够完成体外隐孢子虫完整的感染周期，使得对该疾病的研究取得了阶段性的突破。

3.2.4肠道71型病毒（enterovirus 71， EV71）感染EV71主要感染肠道及呼吸道，以粪口途径和飞沫传播，导致腹泻以及呼吸道症状，同时会在肠道及呼吸道复制进入血液进行其他部位的二次感染，例如神经系统。肺水肿以及肺部病变在EV71致死病例中是常见的［29］。然而，小鼠模型，例如常用的hSCARB2转基因小鼠并不能很好的模拟EV71在肠道及呼吸道中的复制，这使EV71感染宿主细胞的研究阻力重重［30］。Van等［31］使用气道类器官，对EV71感染人气道进行了研究，发现VP1-145为EV1感染的关键因素，并第一次在人体模型中证明这种病毒应变依赖的复制动力学特征。在EV71感染的相关研究中，肺类器官能够模拟人体内感染EV71的过程，更为准确的疾病类型的建立，为进一步的研究提供了可能。

感染性疾病需要研究细胞-病原体间的相互作用的方式，类器官则成为观察这一现象的绝佳选择，在感染性疾病中有很大的研究空间，但是依然存在不足。第一，感染性疾病不只感染肺部，往往伴随着其他器官的变化。以COVID-19为例，多器官衰竭是重症患者的最后结局，想要发现这个过程中各个器官及系统的相互作用，类器官则无法满足。隐孢子虫及EV71感染也对胃肠道有着不可忽视的强烈作用，不同类型的类器官模型在此种情况下将难以建立联系，且在人体内，不同器官间的联系主要通过血液和淋巴循环建立，类器官缺乏相应循环组成也成为形成这一问题的关键点。第二，疫苗作为感染性疾病的重要预防方式，现阶段依然主要依赖动物模型，类器官在此方向还远远不足。

3.3类器官在肺纤维化中的应用肺纤维化是一种肺组织在损伤后，肺部纤维化的肺间质疾病。特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis， IPF）是致死性最强的肺纤维化疾病，有“类肿瘤疾病”之称，病因尚不明确，最终使肺走向衰竭的道路［32］。相关动物模型主要包括药物诱导、吸入粉尘，基因工程实现，但是在时间持续性、纤维化确诊指标、病理特点上都不能复制人类肺纤维化。IPF在病理学上表现为成纤维细胞大量增殖及胶原过度沉积，另外AT2也在IPF中发挥作用［33］。目前，类器官在肝纤维化［34］和囊性纤维化［35］的研究中都有所应用，除了重现器官的结构及功能，还能够展现细胞与细胞、细胞与细胞基质间的相互作用，在纤维化研究中有着独特的优势。

Hermansky-Pudlak综合征（Hermansky-Pudlak syndrome， HPS）相关性间质性肺炎（HPS-associated interstitial pneumonia ， HPSIP），即HPS相关的基因隐性突变导致的间质性肺炎，是一种类似于IPF的临床实体，它们有重叠的表达特征。Xu等［36］发现在HPSIP与IPF的成人患者中，有异常近端标志物的共表达。Strikoudis等［37］通过全基因组表达分析发现HPSIP与IPS纤维化特征的一致性，在类器官中引入HPSIP相关的HPS突变都会引起纤维化发生，证明源自hPSCs的类器官可以作为纤维化肺疾病的模型，同时该研究还发现IL-11可能在肺纤维化过程中起到关键作用，可以作为治疗纤维化的药物靶点。这些证据使得HPSIP成为代替IPF研究的一种方式。除此之外，Suezawa等［38］通过使用hPSCs及原代人肺成纤维细胞建立了博来霉素诱导的肺纤维化模型。Wilkinson等［39］使用三维工程技术，将细胞黏附到肺泡囊模板上，通过旋转重叠的作用实现组织结构，在TGF-β的刺激下，形成明显的瘢痕结构，而这一现象在二维细胞中则不会出现。

类器官为IPF提供了更为精准的研究模型，重现了IPF中经典的瘢痕结构，人源模型也消除了物种差异带来的附加影响，避免了通过IPF动物模型得出的相关线索在人体试验中往往失败的情况。肺类器官创建了IPF模型的长期培养，为慢性IPF的研究提供了可能，解除了目前体外IPF的研究局限于急性研究的窘境。作为IPF模型，肺类器官依然存在局限性：（1）IPF多发于中老年人，需要类器官有更高的成熟度才与疾病状况更为吻合；（2）由于IPF病因未明，类器官培养过程又有多种补充剂的参与，对IPF的发生有更精确的定义才能避免添加物的干扰。

4　总结与展望

作为干细胞领域近十年的研究热点，类器官研究有着非常广阔的发展前景。在药物筛选方面，类器官的三维结构较普通的细胞二维培养更接近人体的真实状态，也有望作为精准医疗筛选药物的方法，对药物使用的临床前研究有着积极的意义；在疾病模型建立、机制研究方面，类器官能够体现细胞-细胞、细胞-微环境，细胞-病原体的相互作用，因此，类器官可以建立个体化疾病模型以及发展个体化治疗；在器官移植方面，虽然目前发展类器官移植还存在许多需要克服的困难，相信在未来的研究取得一步步的进展后，类器官将有希望解决目前肺脏移植资源短缺的问题，挽救更多人的生命。另一方面，类器官但仍然存在许多挑战。第一，人体是一个多器官多系统的复杂结构，而类器官缺乏神经、循环与免疫结构，也无法进行不同类器官间的共同建模，单一的器官不能准确表示器官所处的实际环境。不过，最近Skylar-Scott等［40］通过使用嵌入3D打印技术将血管通道引入3D组织中，Workman等［41］发现了具有功能性肠神经系统的多能干细胞衍生组织，这些新的技术和发现使这一难题有了解决的希望。第二，由ESCs以及iPSCs培育而来的类器官尚欠成熟，更接近于胎儿状态，对于成人疾病的相关研究可能尚有不足。不过，Dye等［42］发现hPSC发展的HLOs体外培养时类似人胎肺组织，移植到免疫缺陷小鼠体内后更像成人肺，而将HLOs置于生物人工微孔聚丙交酯-乙交酯支架，然后体内移植能够得到分泌细胞分化程度更高的肺上皮，接近天然成人肺；Magro-Lopez等［43］发现使用含有地塞米松的混合物（包含CHIR99021、FGF10、KGF、IBMX和8-bromo-cAMP）处理的肺及气道上皮后，可使肺芽类器官成熟，具有更高级更复杂的结构，这些研究可能在一定程度上对这一类器官欠成熟的解决有所帮助。第三，类器官的生长主要由已知肺发育相关的体外因子刺激产生，但对未知的发育环节尚不清楚，而目前其主要依赖于3D基质胶培养，其中加入的动物成分不仅限制了培养条件，也造成了类器官在形状、大小、组成上的异质性。最近，Loebel等［44］使用了物理化学性质较为稳定的水凝胶培养人iPCSs衍生的AT2，发现其不仅能保持AT2的特性，还能降低肺类器官的异质性，有望解决这一问题。总而言之，类器官的出现的确具有重大的意义，但是距离完全模拟体内环境状态仍然需要更多的探索。

［1］ Clevers H. Modeling development and disease with organoids［J］. Cell， 2016， 165（7）：1586-1597.

［2］ Smith E， Cochrane WJ. Cystic organoid teratoma； report of a case［J］. Can Med Assoc J， 1946， 55（2）：151.

［3］ Sato T， Vries RG， Snippert HJ， et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche［J］. Nature， 2009， 459（7244）：262-265.

［4］ Wong AP， Bear CE， Chin S， et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein［J］. Nat Biotechnol， 2012， 30（9）：876-882.

［5］ Dye BR， Hill DR， Ferguson MA， et al.generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids［J］. Elife， 2015， 4：e05098.

［6］ Tan Q， Choi KM， Sicard D， et al. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling［J］. Biomaterials， 2017， 113：118-132.

［7］ Miller AJ， Dye BR， Ferrer-Torres D， et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells［J］. Nat Protoc， 2019， 14（2）：518-540.

［8］ Salahudeen AA， Choi SS， Rustagi A， et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids［J］. Nature， 2020， 588（7839）：670-675.

［9］ Zhang L， Luo W， Liu J， et al. Modeling lung diseases using reversibly immortalized mouse pulmonary alveolar type 2 cells （imPAC2）［J］. Cell Biosci， 2022， 12（1）：159.

［10］ Lau HCH， Kranenburg O， Xiao H， et al. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2020， 17（4）：203-222.

［11］ Lee SH， Hu W， Matulay JT， et al. Tumor evolution anddrug response in patient-derived organoid models of bladder cancer［J］. Cell， 2018， 173（2）：515-528.e17.

［12］ 李圆， 何伟丽， 王宁霞，等. 类器官模型在乳腺癌中的研究进展［J］. 中国病理生理杂志， 2021， 37（10）：1911-1915.

Li Y， He WL， Wang NX， et al. Advances in research of breast cancer organoids［J］. Chin J Pathophysiol， 2021， 37（10）：1911-1915.

［13］ Weeber F， Van De Wetering M， Hoogstraat M， et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2015， 112（43）：13308-13311.

［14］ Sato T， Stange DE， Ferrante M， et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon， adenoma， adenocarcinoma， and Barrett's epithelium［J］. Gastroenterology， 2011， 141（5）：1762-1772.

［15］ Kim M， Mun H， Sung CO， et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening［J］. Nat Commun， 2019， 10（1）：3991.

［16］ Lazarus KA， Hadi F， Zambon E， et al. BCL11A interacts with SOX2 to control the expression of epigenetic regulators in lung squamous carcinoma［J］. Nat Commun， 2018， 9（1）：3327.

［17］ Xu H， Lyu X， Yi M， et al. Organoid technology and applications in cancer research［J］. J Hematol Oncol， 2018， 11（1）：116.

［18］ Sachs N， Papaspyropoulos A， Zomer-Van Ommen DD， et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling［J］. EMBO J， 2019， 38（4）：e100300.

［19］ Hai J， Zhang H， Zhou J， et al. Generation of genetically engineered mouse lung organoid models for squamous cell lung cancers allows for the study of combinatorial immunotherapy［J］. Clin Cancer Res， 2020， 26（13）：3431-3442.

［20］ Han Y， Yang L， Duan X， et al. Identification of candidate COVID-19 therapeutics using hPSC-derived lung organoids［EB/OL］. （2020-05-05） ［2022-07-05］. https：//www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.05.079095v1.

［21］ Pei R， Feng J， Zhang Y， et al. Host metabolism dysregulation and cell tropism identification in human airway and alveolar organoids upon SARS-CoV-2 infection［J］. Protein Cell， 2021， 12（9）：717-733.

［22］ Han Y， Duan X， Yang L， et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids［J］. Nature， 2021， 589（7841）：270-275.

［23］ Samuel RM， Majd H， Richter MN， et al. Androgen signaling regulates SARS-CoV-2 receptor levels and is associated with severe COVID-19 symptoms in men［J］. Cell Stem Cell， 2020， 27（6）：876-889.e12.

［24］ Liesman RM， Buchholz UJ， Luongo CL， et al. RSV-encoded NS2 promotes epithelial cell shedding and distal airway obstruction［J］. J Clin Invest， 2014， 124（5）：2219-2233.

［25］ Chen YW， Huang SX， De Carvalho A， et al. A three-dimensional model of human lung development and disease from pluripotent stem cells［J］. Nat Cell Biol， 2017， 19（5）：542-549.

［26］ Porotto M， Ferren M， Chen YW， et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids［J］. mBio， 2019， 10（3）：e00723-19.

［27］ Heo I， Dutta D， Schaefer DA， et al. Modelling cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids［J］. Nat Microbiol， 2018， 3（7）：814-823.

［28］ Dutta D， Heo I， O'connor R. Studyinginfection in 3D tissue-derived human organoid culture systems by microinjection［J］. J Vis Exp， 2019（151）：e5690.

［29］ Solomon T， Lewthwaite P， Perera D， et al. Virology， epidemiology， pathogenesis， and control of enterovirus 71［J］. Lancet Infect Dis， 2010， 10（11）：778-790.

［30］ Fujii K， Nagata N， Sato Y， et al. Transgenic mouse model for the study of enterovirus 71 neuropathogenesis［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2013， 110（36）：14753-14758.

［31］ Van Der Sanden SMG， Sachs N， Koekkoek SM， et al. Enterovirus 71 infection of human airway organoids reveals VP1-145 as a viral infectivity determinant［J］. Emerg Microbes Infect， 2018， 7（1）： 4.

［32］ Lederer DJ， Martinez FJ. Idiopathic pulmonary fibrosis［J］. N Engl J Med， 2018， 378（19）：1811-1823.

［33］ 连娜琦， 毛靖， 姜淼等. 特发性肺纤维化与代谢失调的研究进展［J］. 中国病理生理杂志， 2022， 38（5）：949-953.

Lian NQ， Mao J， Jiang M， et al. Research progress in idiopathic pulmonary fibrosis and metabolic dysregulation［J］. Chin J Pathophysiol， 2022， 38（5）：949-953.

［34］ Guan Y， Enejder A， Wang M， et al. A human multi-lineage hepatic organoid model for liver fibrosis［J］. Nat Commun， 2021， 12（1）：6138.

［35］ Geurts MH， De Poel E， Amatngalim GD， et al. CRISPR-Based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank［J］. Cell Stem Cell， 2020， 26（4）：503-510.e7.

［36］ Xu Y， Mizuno T， Sridharan A， et al. Single-cell RNA sequencing identifies diverse roles of epithelial cells in idiopathic pulmonary fibrosis［J］. JCI Insight， 2016， 1（20）：e90558.

［37］ Strikoudis A， Cieslak A， Loffredo L， et al. Modeling of fibrotic lung disease using 3D organoids derived from human pluripotent stem cells［J］. Cell Rep， 2019， 27（12）：3709-3723.e5.

［38］ Suezawa T， Kanagaki S， Moriguchi K， et al. Disease modeling of pulmonary fibrosis using human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids［J］. Stem Cell Reports， 2021， 16（12）：2973-2987.

［39］ Wilkinson DC， Alva-Ornelas JA， Sucre JM， et al. Development of a three-dimensional bioengineering technology to generate lung tissue for personalized disease modeling ［J］. Stem Cells Transl Med， 2017， 6（2）：622-633.

［40］ Skylar-Scott MA， Uzel SGM， Nam LL， et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels［J］. Sci Adv， 2019， 5（9）：eaaw2459.

［41］ Workman MJ， Mahe MM， Trisno S， et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system［J］. Nat Med， 2017， 23（1）：49-59.

［42］ Dye BR， Dedhia PH， Miller AJ， et al. A bioengineered niche promotesengraftment and maturation of pluripotent stem cell derived human lung organoids［J］. Elife， 2016， 5：e19732.

［43］ Magro-Lopez E， Palmer C， Manso J， et al. Effects of lung and airway epithelial maturation cocktail on the structure of lung bud organoids［J］. Stem Cell Res Ther， 2018， 9（1）：186.

［44］ Loebel C， Weiner AI， Eiken MK， et al. Microstructured hydrogels to guide self-assembly and function of lung alveolospheres［J］. Adv Mater， 2022， 34（28）：e2202992.

Application of organoid culture technology in respiratory diseases

LI Xiaona， QI Xianmei， ZHANG Tiantian， WANG Jing△

（，，100730，）

Organoid culture is a new biological technology， with significantly higher success rates and lower costs compared with the traditional 2D culture techniques. Organoids provide a new model for the study of organ development and disease as well as drug discovery. In this review， the research progress of organoids in respiratory diseases， such as lung cancer， pulmonary fibrosis and pulmonary infectious diseases， is summarized， and prospects of organoid application are discussed for the further study of respiratory diseases.

organoids； respiratory diseases； stem cells

R-33； R318.13； R56

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.020

1000-4718（2023）02-0366-07

2022-07-15

2022-10-12

［基金项目］国家重点研发计划（No. 2021YFC2500700）；中央级公益性科研院所基本科研业务费（No. 2021RC310002）

Tel： 010-69156477； E-mail： wangjing@ibms.pumc.edu.cn

（责任编辑：余小慧，罗森）