颞下颌关节紊乱病动物模型构建进展

周文成 综述 沈山 审校

暨南大学口腔医学院，广东 广州 510635

动物模型与人类生理特点相似、疾病表征相近、解剖结构相符合的动物，通过实验方法人为地改造或者利用某些动物的天然属性，从而得到能够外推到人类目标群体的真理。它是进入临床实验前不可或缺的的一部分，是基础实验步入临床研究的关键步骤。实验动物可以模拟人类疾病的发病过程、病理改变、临床表现，从而成为目前究疾病病因、发病机制、治疗方法的重要途径。近年来，有关颞下颌关节紊乱病(temporomandibular disorders，TMD)研究的动物模型层出不穷。根据不同的病因和症状，可以采用不同的方式来诱导，主要分为以下四种方式：化学注射法、机械刺激法、手术诱导法、基因工程修饰法。根据TMD的不同病因，采取各种检索方式和选择标准，使用各种搜索词的组合，如颞下颌关节紊乱病、动物模型、实验动物、发病机制。对相关文献、综述、会议文章进行检索、纳入和综述，以寻找TMD的动物模型建立方法。

1 不同化学诱导剂作用机理及评价

1.1 完全弗氏佐剂诱导完全弗氏佐剂(complete freund's adjuvant，CFA)是一种油盐乳液，热灭活的结核分支杆菌悬浮其中，能够有效地诱导抗体生成。CFA活性来自于油滴中免疫抗原的持续释放，并刺激局部免疫反应。Wang等[1]以7周龄雌性SD大鼠为实验对象，在大鼠适应环境后的第1天和第14天分别向大鼠的颞下颌关节(temporomandibular joint，TMJ)上腔注射CFA。在首次注射后的第1天，实验组相对于对照组，头围平均增加了5 mm，提示关节发生严重肿胀，且头部抽离阈值(head withdraw threshold)明显低于对照组，表明实验组大鼠产生剧烈疼痛；实验组大鼠HE染色结果显示大鼠表现出慢性滑膜炎的特征：滑膜衬里细胞增生，伴有大量单核细胞浸润，且关节盘出现增厚和变形；实时荧光定量qPCR(RT-qPCR)结果显示iNOS(诱导型一氧化氮合成酶)、IL-1β(白介素-1β)表达量明显高于对照组，这导致关节盘炎性增厚，湿重和净重增加，胶原蛋白和蛋白聚集多糖含量升高。这些结果验证了Wang等[1]的假设：持续炎症是颞下颌关节退行性变的诱发因素。然而，值得注意的是关节炎大鼠的关节盘前带和中间带的单核细胞总数显著高于对照组，但后带的单核细胞总数在对照组和实验组之间无统计学意义。Barbin等[2]将CFA与牛二型胶原蛋白(typeⅡbovine collagen，CⅡ)混悬液注射入大鼠尾部，5 d后在同一部位进行二次注射。实验组的IL-1β、TNF-α分泌水平明显高于对照组，表明组织处于急性炎症期。而IL-10的表达量却低于对照组。同时组织学分析发现CFA组TMJ髁突顶端区域纤维层、增生层厚度明显低于对照组，同时实验组所有动物均表现出髁突软骨和软骨下骨胶原纤维退化，胶原纤维数量减少。McIlwrath等[3]通过将CFA注射入TNF-α缺失小鼠颞下颌关节内并联合结肠刺激构建了“双重打击”TMD炎症模型。具体的构建过程如下：TNF-α受体缺失小鼠麻醉后于TMJ关节腔内注射CFA，称为一次打击。三周之后麻醉小鼠，将聚乙烯管插入结肠内，再通过注射器注入芥子油，称为二次打击。行为学反应测定结果表明CFA诱导的实验动物单侧头部抽离阈值显著降低，在注射后第一天降低幅度达到最大，提示动物可能对机械刺激更加敏感，在第五天恢复至基线水平。而热平板实验结果在野生型和突变型小鼠之间没有差异。细胞因子检测结果显示促炎因子在CFA刺激后明显增加，尤其是在诱导后的第14天，例如TNF-α、CCL5、CXCL9、CCL2、CXCL10等，提示组织可能处于急性炎症期。CFA诱导的小鼠对福尔马林注射入唇引起的急性炎症反应程度更加剧烈，表明二者可能存在协同作用。笔者认为CFA是目前动物实验常用的免疫诱导制剂，可以使抗原持续释放，同时又能非特异性地诱导机体的免疫性应答，一般多用于诱导实验动物的初次免疫。但注射CFA而导致的局部组织炎症、肉芽肿性改变，是否会对实验产生不良影响，目前仍需要验证。且CFA诱导制剂起效快，失效也快，不适合进行短期暴露。同时利用CFA的大多数动物模型都集中在小型啮齿动物上，因此在大型动物模型中将需要更多的研究，以确保结果的普适性。

1.2 卵蛋白诱导类风湿性关节炎(rheumatoid arthriti，RA)是一种自身免疫性疾病，可累及手足小关节和颞下颌关节，同时伴有全身的其他表现。血管生成是其发病机制的重要组成部分，血管生成可以促进局部炎症细胞迁移和疼痛受体的增加。因此检测血管翳生成情况是评估RA活动性及不同疗法效果的重要内容。Liu等[4]创建了卵蛋白诱导兔关节炎模型(ovalbumin induced arthritis，OIA)，使用纵向能量多普勒血流显权像(power doppler imaging，PDI)和对比增强超声(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)测量来评估疾病不同阶段的血管生成情况，并分析测量值与血管生成的不同病理指标之间的相关性。具体模型建立方法如下：雄性新西兰大白兔作为实验组注射鸡蛋清的白蛋白和CFA的混合液，对照组接受等量生理盐水注射。16周后，使用超声(ultrasoun，US)作为常规评估手段，超声引导下对OIA兔膝关节滑膜进行活检，免疫组化检测CD31和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。结果显示：第6～12周，OIA兔的滑膜中CD31和VEGF表达增加，同时其表达量与能量多普勒图像分级、CEUS分级和峰值强度呈显著正相关。将功率多普勒图像等级、CEUS等级和峰值强度，尤其是CD31表达量结合时，准确地表明了RA兔模型中滑膜血管化的程度。笔者认为新西兰大白兔体型较大、体质结实、成熟早、生长快，由于其耳大、皮肤白色和血管清晰等特点，是一种用于研究RA疾病的理想动物。同时该动物模型成功模拟了人类RA的疾病进程，实验兔在第6～8周出现早期疾病表现(炎症)，在第8～12周出现中期疾病表现(血管翳形成)，在第12～16周出现晚期疾病表现(纤维化)，为学者了解RA的发病机制打下了深厚的实验基础，同时有利于学者更好地对RA病情进行评估。但目前由种属差异、饲养环境不同带来的实验结果的差异仍然是一个急需解决的问题。

1.3 胶原酶、胶原抗体诱导骨关节炎(osteoarthritis，OA)的治疗药物选择十分有限，需要替代治疗。大量临床数据表明，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)可能是人类OA的治疗靶点。Lee等[5]通过构建胶原酶诱导性骨关节炎模型(collagenase induced arthritis model，CIOA)，在大鼠关节腔内注射Ⅱ型胶原酶对照组注射生理盐水，在CIOA诱导成功后，腹腔注射GM-CSF单克隆抗体，第23天出现了持续性疼痛，组织学检测证明该组出现了明显的软骨损伤。半月板损伤是膝关节骨性关节炎发生和发展的危险因素之一，但聚焦在半月板损伤上的动物模型却鲜有报道，在CIOA模型中，还没有关于半月板退行性变的研究。在这种模型中，高纯度的胶原酶被注入关节内，损伤了关节韧带，导致关节不稳定。Utomo等[6]构建了这种CIOA模型，C57BL/6小鼠关节内注射胶原酶诱导膝关节骨关节炎。分别于1 d、3 d、7 d、14 d、28 d、56 d处死小鼠，取膝关节进行组织学分析。取16周龄未诱发骨性关节炎的小鼠膝关节作为对照。经硫胺染色切片评估半月板损伤、半月板脱出和关节软骨损伤。结果表明半月板损伤与关节软骨损伤发生在同一时间，半月板退行性变发展主要依靠对表面结构、细胞密度和基质染色的评估，从第14天开始，这三个参数与对照组相比都有随时间增加的趋势，CIOA组膝关节的半月板损伤和关节软骨损伤呈中度相关。这些结果表明CIOA模型是研究半月板损伤与OA进展相关性的作用的重要模型，并可以为OA治疗方法研究奠定基础。Matsuo等[7]以C57/BL小鼠为实验动物，通过皮下注射胶原单克隆抗体合剂构建的实验鼠被称为胶原抗体诱导的关节炎模型(collagen antibody induced arthritis model，CAIA)，然后进行Col1a2-GFP小鼠的骨髓移植。Col1a2-GFP转基因小鼠在伤口愈合过程中及肝纤维化、肺纤维化和脂肪组织纤维化模型中出现的成纤维细胞，可以产生Ⅰ型胶原纤维并表达GFP，被称为GFP阳性细胞。胶原抗体注射后(第0天)，GFP细胞数量在第5～8天达到顶峰，之后10 d内持续升高，然后逐渐下降。同时发现CAIA小鼠组织中出现大量的的GFP细胞。同时还发现所有的GFP阳性细胞均表达成纤维细胞所有的标志蛋白，因此认为小鼠体内的GFP细胞均为成纤维细胞。笔者认为CAIA、CIOA模型操作简单、损伤可控和可重复性高,但至少四周后才能出现OA样病变，耗时较长；Matsuo等[7]构建的CAIA动物模型对于RA的病理学研究上意义非凡，但对于RA(类风湿性关节炎)动物的行为学表现、细胞学以及免疫学水平的研究却没有涉猎。

1.4 血管内皮生长因子诱导Shen等[8]以48只10～12周龄的SD大鼠为实验对象，分为VEGF注射组、生理盐水注射组、空白对照组，每组各16只，分别在1、2、4、8周取材，每次取四只，HE染色观察发现与其他两组相比，VEGF注射组髁突软骨肥大层厚度明显变薄，且随时间延长，厚度进一步降低；在第4周、第8周，髁突软骨层出现空泡性变、变性等病理学改变；软骨细胞多糖含量明显降低，软骨细胞排列逐渐变得紊乱；从第2周开始，VEGF组Mankin评分(学术界公认的对骨性关节炎软骨退变程度进行评价的通用标准)明显高于其他两组，提示该组退行性病变更加明显。此外Micro-CT显示VEGF组出现了软骨下骨的骨性病变、局部硬化，同时骨小梁数量和骨小梁排列明显高于其他组。免疫组化分析显示：VEGF组MMP-9、MMP-13明显高于其他组，且Tunel阳性细胞数明显多于其他组。实验证实VEGF可能通过VEGF2受体上调软骨细胞中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和MMP-13的表达，导致软骨细胞凋亡，从而导致软骨退变，该模型可以用来探讨颞下颌关节骨关节炎(temporal mandibular joint osteoarthritis，TMJ-OA)的分子机制。笔者认为大鼠关节腔内注射VEGF的确可以使大鼠变现出OA的基本病理变化：软骨退变、软骨下骨吸收，为探讨TMJ-OA发病的分子学机制建立了一个成功的动物模型。但诱导周期为56 d，相对较长。且在软骨生长过程中，VEGF在滑膜细胞和软骨细胞中表达，VEGF及其受体均在浅表软骨细胞层中被检测到，如何排除内源性VEGF的干扰也是该模型急需解决的问题。

1.5 木瓜蛋白酶/单碘酸盐(monoiodate，MIA)Guzman等[9]以雄性Wistar大鼠为实验对象，将单碘酸盐注入大鼠关节腔内，分别在注射后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d和56 d处死取样。在MIA注射后第1天，组织学观察发现胫骨平台区域出现大范围的软骨细胞变性，并伴有轻度到中度的淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润；在第7天可观察到破骨细胞数量增加，受损坏死的软骨细胞和软骨下骨连接在一起；在第14天梭形细胞取代了原有的软骨下骨髓，并与正常的骨小梁，骨髓细胞之间界限清楚；在第28天，出现多灶性骨小梁塌陷和碎裂，碎裂骨被大量破骨细胞包围，偶可见软骨下硬化区域。Cledes等[10]以雄性新西兰大白兔为实验对象，关节下腔单碘乙酸钠溶液，分别在10 d、20 d、30 d、40 d麻醉后处死取材。实验结果如下：(1)髁突软骨和软骨下骨改变：在第10天，实验组病变主要集中在关节的前部和中央区，损伤区软骨细胞增厚，软骨下骨出现薄薄的结膜凹陷，骨软骨连接的完整性被破坏，髁突软骨的4层典型结构消失；在第20天软骨变薄，在关节内侧被纤维组织替代，软骨下骨出现吸收；而在30 d时，软骨完全被纤维组织替代；40 d时，关节腔内有一大片无软骨的损伤区，软骨下骨外露，其肥厚层(下层纤维软骨层)显露出来。观察可以发现软骨细胞形成一条粗大的连续线，清楚地将小的骨缺损与软骨下骨分开。40 d时，关节间盘发生穿孔，并在双板区层显示骨化过程。(2)滑膜变化：MIA注射组兔的关节滑膜均出现纤维化、增生，前、后隐窝绒毛发育一系列病理变化。Molinet等[11]向雄性新西兰大白兔分别注射MIA、木瓜蛋白酶作为实验组，在实验开始的第15天、第30天、第45天麻醉后处死取材。实验结果如下：(1)MIA诱导组：髁突表面发生变形，软骨细胞稀少，髁突形态和软骨细胞细胞膜消失，甚至出现空斑。在45 d时，MIA组所有变量的平均值的增加比对照组更明显。(2)木瓜蛋白酶诱导组：髁突关节面不规则，细胞外基质明显增多，中层软骨细胞排列紊乱，深层软骨细胞增生。关节囊变薄，中层软骨细胞呈孤立排列，髁突和关节盘之间的关节间隙明显缩小。(3)关节盘改变：30 d时仍有周边撕裂，软骨细胞数量较少，外缘不规则，但关节盘形态仍可保持但中部出现穿孔，边缘软骨细胞稀少。在木瓜蛋白酶诱导的TMJ-OA中观察到关节盘有撕裂的迹象，但其中仍可见软骨细胞。笔者认为Guzman等[9]在关节内注射MIA可以诱导关节软骨的丢失，并导致类似OA的软骨下骨病变的进展。提供了一种快速和微创的方法，在啮齿类动物中复制OA样病变，结果可靠、造模方便。Cledes等[10]选择雄性动物作为实验对象，有效地规避了雌激素对于骨、软骨代谢的影响，且MIA注射仅在关节下腔进行，以获得退变过程的平稳进展，并符合人类临床上主要涉及髁突软骨的病理发展。MIA在第30天便可诱导动物出现关节炎晚期表现，这与其他造模方法相比，诱导速度更快，这可能与MIA对软骨细胞的直接作用有关，比机械应力单独引起的代谢变化更快。此外用化学诱导观察到的变化不仅与退变过程一致，而且与软骨损伤修复过程相吻合的。因此，所有关节的缺损周围都有肥大的软骨反应，与骨关节炎的初始和修复阶段一致(软骨细胞增殖，新陈代谢增强，软骨增厚)。但对于OA样表现动物的观察方法过于局限，基于现代免疫学发展基础上的免疫组化染色以及Micro-CT观察或可以得到更为翔实的实验结果。

1.6 雌二醇诱导瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid-1，TRPVl)是一种非选择性的阳离子通道，最初被鉴定为辣椒素受体，主要表达于外周神经系统，不仅在滑膜内分布的神经和血管中表达，而且在大鼠和人颞下颌关节的滑膜衬里细胞中也有表达，在辣椒素、酸、热、内源性配体等疼痛性刺激的检测中发挥关键作用[12]。TRPV1的表达和致敏受神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的调控。在感觉神经元中，TRPV1的激活会诱导炎症神经肽的释放，从而引起神经源性炎症和疼痛[13]。Wu等[14]以SD大鼠为实验对象，将大鼠随机分为5组，假手术组以及4组卵巢切除鼠(ovariectomize，OVX)，分别接受剂量为0、20 mg、80 mg或200 mg的雌二醇(estradiol，E2)，连续注射12 d，去卵巢大鼠接受上述剂量的雌二醇后，血浆可产生不同水平的雌二醇，假手术大鼠皮下注射等量的玉米油，并最后取颞下颌关节作为标本。Western blot结果显示：与假手术组相比，卵巢切除鼠雌二醇以剂量依赖性模式上调TRVP1的表达。之后体外提取原代滑膜细胞，使用雌二醇和LPS(脂多糖)处理滑膜细胞。结果表明雌二醇和LPS均能上调滑膜细胞TRPV1转录，单独应用NGF的诱导作用更显著，抗NGF血清预处理可以完全阻断了雌二醇和LPS联合治疗产生的TRPV1的诱导。同时进行的TRVP1激动剂处理滑膜细胞实验表明：TRVP1可以上调COX-2 mRNA(cyclooxygenase，COX，环氧化物酶)水平。以上结果表明：雌二醇很可能是通过痛觉相关基因(TRVP1)来参与TMJ炎症或疼痛的形成机制，这有利于颌面外科医生理解TMD患者疼痛发生的性别差异。Jie等[15]采用与Wu等[14]相同的造模方式，然后使用谷氨酸构建咬肌疼痛模型。结果表明：与对照组相比，谷氨酸可以显著降低头部撤离阈值，且降低程度与浓度呈正相关，且雌二醇剂量依赖性加重了谷氨酸诱导的头部撤离阈值的降低，增强谷氨酸诱导的咬肌伤害性反应。笔者认为过量激素使用会对大鼠短时间造成不可逆的损害，具体的雌二醇剂量如何把控，目前仍需详加研究。且大鼠饮食的是否含有豆类等可能会使内源性胆固醇升高的食物，实验中并未详细说明。Jie等[15]在实验过程中，为确定动物咬肌注射谷氨酸的适宜浓度，根据谷氨酸浓度效应数据计算半最大效应浓度(concentration for 50%of maximal effect，EC50)，这样可以确定最适宜的浓度，以便在保证最佳实验结果的前提下，尽量减少对动物的损害，符合爱护实验动物的基本原则。

1.7 卡拉胶诱导P2X受体是由细胞外ATP激活的配体门控离子通道家族，在伤害感受中起作用。功能性P2X受体在大鼠的一些感觉传入神经上表达，在炎症介质存在下，P2X受体介导的伤害性反应也会增强[16]。为了探讨内源性三磷酸腺苷在颞下颌关节痛性致敏中的作用，Oliveira等[17]构建了卡拉胶诱导的关节炎模型，分别给予P2X受体激动剂、P2X受体拮抗剂，观察其对卡拉胶诱导的颞下颌关节炎性痛敏的影响。实验结果表明与对照组相比，卡拉胶预处理后，5-羟色胺可以显著增强诱导产生的伤害反应，而在应用P2X受体拮抗剂后，该诱导作用显著降低，P2受体拮抗剂与卡拉胶合用可剂量依赖性地降低卡拉胶引起的TMJ痛敏反应。颞下颌关节紊乱病受到生物介质、社会心理、机械运动、外周和中枢的痛觉信号、关节的使用频率和强度的影响，但对于这些因素之间的相互作用却知之甚少。而TMD的诱发因素包括儿茶酚-O-甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)基因多态性及其报道与疼痛耐受性相关的改变、中枢神经系统功能的改变。当其中一个因素与颌骨负荷过载等触发因素结合时，就会产生持久性或长期的TM系统敏化[18]。因此为了研究始发因素和各种诱导因素对TMD的致病作用及它们之间的相互作用，Phero等[19]研发了一种咬合功能相关疼痛测试仪，适用于卡拉胶诱导的咬合功能障碍大鼠，使其分别在感染、无感染、COMT抑制剂处理条件下，评估大张口对于咀嚼功能的影响。测试结果表明：卡拉胶注射后动物长咀嚼时间小幅度增加，而在经地塞米松处理后，该诱导作用被削弱了，此外由卡拉胶引起的强烈炎症可以增强大张口对咀嚼功能的影响，从而导致颞下颌关节功能障碍，这表明局部炎症与大张口运动对于诱发TMD存在协同作用。据报道，没有TMD病史的受试者很快便能适应实验咬合干扰，而有TMD病史的受试者(尤其是有口腔颌面部疼痛史的受试者)临床症状则明显增加[20]。为了探究先前的疼痛经历是否会加剧咬合干扰引起的咀嚼肌痛觉过敏。Ding等[21]开发了一种两次交叉注射卡拉胶建立炎症性痛觉记忆模型，使用金属丝抬高咬合，观察大鼠痛觉过敏相关行为。结果表明：第一次注射卡拉胶后第5天，右咬肌(注射侧)的头部撤离阈值明显降低，在咬合抬高0.4 mm后，头部撤离阈值降低程度更为明显，而注射生理盐水组在抬高咬合后，头部撤离阈值无明显变化，结果表明疼痛记忆可以增强咬合干扰引起的咬肌痛觉过敏。且在拆除颌面金属丝、恢复咬合后，卡拉胶注射组较生理盐水注射组头部撤离阈值恢复至正常水平时间明显延长，根据以上结果，初步认为炎性疼痛记忆促进了咬合干扰诱发的咬肌疼痛。笔者认为：(1)卡拉胶注射为探讨炎症介质释放的时程及抗炎药物对炎症介质释放的调控提供了一种重复性好、结果可靠的方法，但Phero等[19]进行的实验，研究的诱发因素较多，如何设置好各相关因素之间的对照实验，以及如何设计联合多因素干预实验，从而获得可信的结果仍是一个不小的挑战。(2)Ding等[21]以SD大鼠为基础建立的实验动物模型存在一些缺点，大鼠口腔小，操作困难，且啮齿类动物均存在夜磨牙习惯，因此难以建立相对稳定的创伤咬合关系。猪、猴、犬等体积相对较大的动物，操作起来更为方便，且咀嚼习惯、食性、TMJ解剖关系、组织结构等与人体更为相似，更加适合作为咬合紊乱的动物模型，但相对来说，上述动物更加难以获取，价格较为昂贵。

1.8 福尔马林诱导福尔马林作为一种伤害性刺激，最早应用于疼痛相关研究的动物实验。最早在1987年有学者曾以福尔马林为诱导剂，注射入大鼠爪内，大鼠产生了双向伤害性反应，吗啡、哌替啶可以缓解实验所带来的痛苦[22]；之后，Shibata等[23]又使用福尔马林作为诱导剂，广泛应用于动物电生理实验，从而使实验动物再现损伤后疼痛的基本特征。Roveroni等[24]将不同浓度的福尔马林注入大鼠TMJ区域以创建TMJ实验性疼痛模型。结果发现，浓度高于1.5%以上的福尔马林诱导45 min后，其导致大鼠产生的行为反应(包括头部回缩和口面部摩擦)更加剧烈，类似于卡拉胶诱导的行为反应。在该模型中，通过测量行为伤害性反应来评估TMJ痛敏反应的剧烈程度，例如摩擦口颌面部区域并甩头。15d-PGJ2中文名称为环戊烯同类前列腺素，是一种过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)配体，一旦其被激活，可引发一系列连锁反应，增强免疫调剂作用以及神经保护作用，Abdalla等[25]已经通过相关实验：将15d-PGJ2(利用纳米技术封装15d-PGJ2，从而降低其有效剂量并提高其利用度而制成的胶束系统)直接注射入TMJ，可以刺激PPAR-γ，从而发挥潜在的抗炎作用。为了评估了PL-15dPGJ2胶束系统在福尔马林诱导的大鼠颞下颌关节急性疼痛模型中的治疗效能，Abdalla等[25]将PL-15dPGJ2注射入大鼠关节腔内，再使用福尔马林诱导，观察大鼠的行为学反应，并在诱导后的第1、2、3、7、10、14天处死大鼠，取颞下颌关节组织行相关检查。结果表明PL-15dPGJ2预处理可以显著降低福尔马林诱导所产生的大鼠伤害性行为反应，且PL-15dPGJ2预处理后可以降低血液外渗和白细胞迁移，维持效果长达7 d，与此同时，PL-15dPGJ2改善了促炎细胞因子和趋化因子的蛋白质表达水平。这些结果提示PL-15d-PGJ2制剂具有确切的抗伤害感受和抗炎作用，是治疗颞下颌关节或其他关节疾病的炎症性疾病的潜在选择。笔者认为福尔马林诱导大鼠作为急性疼痛模型，存在诱导时间短、诱导效果好，且可重复性高，行为学反应可量化的优点。但在福尔马林诱导的动物学反应中观察发现，动物若表现出强烈的摩擦活动行为，而畏缩行为出现频率就会降低，反之亦然。福尔马林诱导的摩擦和退缩反应仅在浓度高于0.5%时出现，且在浓度为1.5%及其以上时，所诱导产生的下颌骨运动反应并未增加，表明福尔马林可能存在一个最适宜的诱导浓度。

1.9 TNF-α诱导TNF-α是炎症通路中的一种重要的细胞因子，存在于RA患者的滑膜、滑液及血清中。TNF-α通过与多种组织因子和基质蛋白相互作用促进RA的炎症反应、滑膜细胞异常增殖和凋亡、血管翳生成及软骨与骨的破坏，推动RA炎症反应持续性进展[26]。Ruscitto等[27]选用8周龄C57BL/6小鼠作为实验鼠，颞下颌关节腔内注射重组TNF-α，对照组注射等量生理盐水，处死后进行相关检测。结果表明：TNF-α诱导组大鼠出现了急性炎症，Adamts5(血小板反应蛋白解整合素金属肽酶-5)、IL1-β表达量上调及细胞外基质转换增加。实验结果表明：TNF-α是RA发生发展的重要推动和维持因素，因而进一步研究TNF-TNFRs在RA中作用机制和特点以及寻求针对TNF-TNFRs更加有效的治疗方法和药物是十分必要的。笔者认为RA患者血清中存在较高水平的TNF-α及其可溶性受体，且有研究证实TNF-α与类风湿因子滴度、C-反应蛋白呈正相关关系。因此笔者认为TNF-α不仅可诱导大鼠产生TMJ-RA(temporomandibular joint rheumatoidarthritis，TMJ-RA)，而且其本身也是RA的重要检测指标之一，因此如何排除内源性TNF-α对诱导实验的干扰是必须需要考虑的。

1.10 白蛋白诱导环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid，EETs)是一种内源性抗炎化合物，可以减轻炎症，并具有镇痛、抗纤维化和降压作用。而可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolas，sEH)的活性作为EETs生物利用度的主要决定因素之一，可将EETs迅速转化为活性较低的形式，从而降低生物效应。抑制sEH酶已被用作降低伤害感受和炎症的一种策略[28]。Quinteiro等[29]在Wistar大鼠背部皮下注射含有CFA的甲基化的牛血清蛋白(methylated bovine serum albumin，MBSA)乳剂，从而诱导产生一种以MBSA为抗原的迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity，DTH)的实验模型。白蛋白诱导的大鼠颞下颌关节关节炎引起了高度伤害性反应，白细胞聚集，促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、CINC-1(中性粒细胞趋化因子)、IL-17、IL-23和IFN-γ的表达上调。TPPU(一种sEH酶抑制剂)外周预处理可抑制关节炎诱导的颞下颌关节伤害性反应和白细胞迁移。此外，TPPU可降低TMJ组织中促炎细胞因子的局部浓度，上调抗炎细胞因子IL-10的表达。TPPU可显著降低诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，INOS)的蛋白表达，但不改变甘露糖C样受体1(monoclonal antibody to mannose receptor C type 1，MRC1)的表达。该研究证实TPPU外周给药可减轻颞下颌关节实验性关节炎的过敏性痛觉和炎症，表明抑制sEH酶可能成为减轻关节炎疼痛和炎症病理效应的新靶点和新策略[30]。Kato等[31]在DBA大鼠尾部注射牛Ⅱ型血清白蛋白(含有乙酸-完全弗氏佐剂)，并在21 d后进行加强免疫，同时对动物进行关节炎症评分[32]。结果发现与对照组相比，实验组TRAP(tartrate resistant acid phosphatase,抗酒石酸酸性磷酸酶)阳性细胞多核细胞、ALP(alkaline phosphatase，碱性磷酸酶)阳性细胞数量明显增高，表面破骨细胞分化活跃同时碱性磷酸酶活性显著提高；采用荧光定量PCR技术分析发现骨形态发生蛋白相关基因如Runx2、Alph、Bglap i3表达水平均显著降低，关节炎症评分也从第21天到第30天持续走高；关节炎症指标基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase，MMPS)表达上调、脾胀重量也普遍增大。而在进行OP3-4[一种类似骨保护素(OPG)的肽，OPG上有3个RANKL结合位点]注射治疗后，在OP3-4剂量较高时，会降低关节炎评分。结果表明OP3-4显著降低了CIA诱导的血清CTX(Ⅰ型胶原羧基端肽序列，反映机体骨代谢的重要标记物)的水平。OP3-4可以防止骨质流失，抑制骨吸收，促进骨骼形成。笔者认为白蛋白注射诱导同样时间长，且往往只能模拟TMD诱发因素的某一项，且主要聚焦在啮齿类动物，针对其他动物的实验研究仍需努力。

1.11 IL-1β诱导有研究发现颞下颌关节疼痛患者关节滑液中的IL-1β、IL-1RⅡ明显高于正常值[33]，I-1β(白介素1-β)可诱导TMD患者中异常分子的增加，主要包括：IL-6、IL-8、RANKL(单核细胞系破骨细胞前体上表达的与RANK作用的一种跨膜蛋白)、MMP3、MMP13等[34]。IL-1β通过促进滑膜细胞和软骨细胞的合成并释放前列腺素E(prostaglandin E，PGE)、胶原酶和过量的MMPs，并诱导其释放磷酸酶A，从而抑制蛋白多糖的合成，间接参与TMD的病因机制。Chu等[35]为了探究细胞周围基质(pericellular matrix，PCM)分子在颞下颌关节软骨细胞和关节盘细胞的合成代谢和分解代谢反应中的作用，在促炎分子IL-1β诱导前先用PCM分子预处理细胞以刺激骨关节炎发生。结果表明IL-1β处理后，与基质降解相关的基因如：MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS均表达上调，而软骨基质基因如：ACAN、COL-1、COMP均表达下调。这些结果表明IL-1β的确可以诱导TMJ-OA模型产生。笔者认为TMJ-OA炎症反应过程中，IL-1β是主要的促炎细胞因子，它可以刺激软骨细胞释放炎症介质，导致组织损伤并促进MMPs的产生。IL-1β可能是颞下颌关节关节盘病变过程的主要促炎细胞因子，其可能在TMJ低度炎症反应环境中促进炎症反应，并诱导关节盘细胞产生MMPs降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。因此笔者认为IL-1β具有诱导效能高、诱导时间短等优点。但IL-1β与IL-1α之间还存在交互作用，具体在诱导过程中两者之间是否互为干扰，目前尚未可知。针对于细胞实验，IL-1β已经有了确切的浓度和诱导效能、但使用IL-β诱导动物产生TMJ-OA的实验目前比较少，聚焦于实验动物的诱导效果，IL-β的表现值得期待。

2 不同机械刺激诱导方法及其评价

2.1 单侧夹板固定诱导支持下颌运动是颞下颌关节的主要作用之一，而小型动物颞下颌关节的机械特性难以确定，为了确定兔的解剖结构和生理特性、行为学特征是否可作为TMD实验动物，Henderson等[36]以新西兰大白兔为实验对象，通过牙科酸蚀剂加光固化树脂将1 mm厚的金属夹板固定在右侧上下颌磨牙上，6周后处死取材。C-Fos免疫组织化学(IHC)检测Fos阳性神经元数量(Fos-LI，以下简称Fos阳性神经元)可作为伤害性活动的一种量度。番素-O固绿染色观察纤维软骨细胞的分布和形状，结果显示夹板组兔子(以下简称夹板兔)行为学反应程度弱于对照组，夹板兔组中观察到了更多的Fos阳性神经元，夹板兔组组织学观察发现沿着髁突前后径长轴，糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAGs)的分布中断，不能覆盖整个前后径长度。TMJ上组织的机械探测的敏感性增加、三叉神经尾亚核中Fos阳性神经元的增加以及TMJ传入神经的兴奋性增加。机械超敏反应表现中观察到的变化可能是兔模型的一个重要特征，增加了其与临床表现的相关性。笔者认为本实验采用兔为实验动物，是因为兔颞下颌关节具有与人类相似的侧向和前后向运动，而且经实验诱导产生的病理改变与人类TMD的病理改变相似，该动物模型是研究人类TMD的理想实验动物模型。本实验用金属夹板加光固化树脂的方法，造成兔局部咬合抬高的咬合紊乱动物模型，克服了磨耗等因素造成干扰减弱对实验结果带来的影响。

2.2 颌面金属丝抬高咬合诱导El-Hakim等[37]发现糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)是免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，在多种细胞类型中表达。研究已经将RAGE定义为一种模式识别受体，其结合内源性S100/钙粒蛋白，淀粉样蛋白β肽和HMGB-1(或两性霉素)，通过激活的信号转导途径影响特定的基因表达。具体而言，许多促炎反应，例如由蛋白激酸磷酸酶(mitogen activited protein kinase，MAPK)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、活性氧和TNF、IL-1、TGF-β(transforming growth factor-β，转化生长因子-β)等其他促炎介质协调的炎症反应是由RAGE-配体相互作用引起的。为了研究非侵入性方法构建的TMJ-OA动物模型是否有效，以及RAGE在TMJ-OA发生发展中的作用。Matias等[38]以C57BL小鼠为实验对象，使用牙科树脂加黏结剂将1.2 mm厚、2.5 mm长的“U”形金属丝固定在第一臼齿上，U形开口朝向远中，确认金属丝无移位后，在第2、4、6、8周处死小鼠取材。组织学检测发现：咬合抬高组小鼠(以下简称实验鼠)软骨显示出表面颤动，实验鼠Mankin评分远高于对照组，差距具有统计学意义，免疫组化染色结果显示：实验鼠MMP13、TGF-β1、丝氨酸肽酶1(htra serine peptidase 1，HtrA1)远高于对照组。笔者认为由于错合模型的机械发病机制类似于人类OA的发病过程，所以这种模型是探讨TMJ-OA的发病机制和治疗方法的理想选择。此外该模型还具有造价低、高度可重复、非侵入性等优点。尽管咬合抬高可以诱导动物发展为早期颞下颌关节OA，但这并不能模仿人类疾病的自然发作和进展，若能创建一种错颌畸形小鼠模型，以更自然的方式诱导发生TMJ-OA，以更好地模拟人类疾病的进展，这将是一个全新选择。

2.3 错合障碍实验模型Jiao等[39]通过正畸方法设计了错颌畸形，称为错合障碍实验模型(experimentally created disordered occlusion，ECDO)。以SD大鼠为实验对象，将直径约1 mm的弹性橡皮筋插入左上颌第一和第二磨牙之间以及右下颌第一和第二磨牙之间。这样，第一磨牙在橡皮筋的弹力作用下向内侧移动。一周后，将橡皮筋更换为自固化树脂以保持间隙直到实验结束。初次操作后4周，咬合紊乱程度进一步加重，使用相同的方法向远中推动左上第三磨牙和右下第三磨牙。在此手术后的第8周和第12周，可以观察到明显的骨髓性骨质损失伴随着髁突软骨降解，随后软骨细胞的凋亡增加，并发现其与性别有关并随时间进行性发展，并且伴随着OA样病变。此外，在发生降解的关节软骨中发现了具有增强的吞噬活性的CD163+(清除剂受体半胱氨酸的超家族的富含超家族成员)软骨细胞数量增加，这提供了一种治疗TMJ-OA的新策略。笔者认为该模型较好地复刻了人类TMJ-OA进程中软骨改变、促炎因子分泌增加、组织学表现，因此可作为研究TMJ-OA的合适模型。然而，Jiao等[39]的实验结果表明：OA的发生发展可能与性别相关，但并没有给出具体的理由，且该种造模时间最长达12周，同时由于大鼠和人类之间的咬合障碍类型和TMJ结构的明显差异，这种OA样病变不能完全与人类TMJ-OA相等。

2.4 单侧前牙反合模型Wang等[40]以SD大鼠为实验对象，将一根金属管(长约2.5 mm，直径3 mm)黏结在大鼠上前牙上，另一金属管(长约4.5 mm，宽约3.5 mm)黏结在下前牙上，用力弯曲使金属管唇倾135°，使用水门汀固定，构建了单侧前牙反模型(unilateral anterior crossbite，UAC)。在第3天、1周、2周后处死取材，对实验组和对照组大鼠均进行组织学观察、免疫组化染色、软骨厚度测量和图像分析、荧光定量RT-PCR。实验组中诱导了髁突软骨中细胞和局部无细胞区域的不规则排列。观察到软骨细胞的数量和大小减少，软骨肥厚层厚度减小；增殖细胞核抗原抗体(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、COLⅡ(typeⅡcollagen，Ⅱ型胶原蛋白)、AGG(aggrecan,蛋白聚集多糖)和TIMP-1(tissue inhibitors of metalloproteinase 1，基质金属蛋白酶抑制因子-1)的mRNA表达水平也有所下降；在不同时间点，MMP3、MMP9和MMP13的mRNA表达水平也有所增加。实验结果表明UAC模型可诱导大鼠颞下颌关节软骨退化。咬合调整对于实现最佳的牙齿咬合和咀嚼功能是必要的[41]，实验性错合模型对于诱导咀嚼肌变化的分子学机制研究，至今鲜有报道。Zhang等[42]以与Wang等[40]相同的造模方法，不同的是，Zhang等[42]主要研究UAC对于提下颌肌-咬肌、降下颌肌-翼外肌的影响。在同样的时间节点处死动物后取材，测量咬肌、比目鱼肌、翼外肌、趾长屈肌的重量指数，结果发现在3 d～2周内，UAC组大鼠与对照组相比，各肌肉的重量均无差异。与对照组相比：(1)UAC组αB-crystallin(αB-晶状体蛋白，一种热休克蛋白，可阻止应激条件下蛋白质聚集，小鼠比目鱼肌再加载损伤可促进其表达)由于UAC装置的存在其表达下调，在拆除UAC装置后，表达转而上调，差异具有统计学意义；(2)UAC组Desmin(结蛋白，一种中间丝蛋白，在受伤的骨骼肌纤维中含量增加，受损的肌肉组织被炎症细胞去除，表明肌肉受伤后正在迅速修复)表达量差异无统计学意义，在拆除诱导装置后也无明显变化。炎症反应表现为UAC组炎症细胞的浸润和TNF-αmRNA表达的增加及纤维化反应，表现为Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达增加。这些反应因拆除诱导装置而部分恢复。Liu等[43]为了验证UAC诱导的焦虑和相关行为，神经生理学和生化变化并探究咬合异常和焦虑之间的神经传导通路，采取了与Wang等[40]一样的UAC造模方式。造模后UAC组分别进行迷宫测试、开放场测试，使用电流和电压钳夹技术记UAC组和对照组LHb神经生理特性；检测外侧缰核(lateral habenular nucleus，LHb)中囊泡型谷氨酸转运蛋白2(vesicular glutamate transporter 2，VGLUT2)的表达变化，来研究UAC诱导对焦虑的潜在反应；使用Western blot(蛋白印迹实验)检测三叉神经中脑核(mesencephalic nucleus of trigeminal nerve，Vme)中VGLUT2蛋白水平；使用生物素标记的葡聚糖胺作为示踪剂进行神经元束示踪，共聚焦激光扫描显微镜观察。结果表明LHb神经元活性升高，LHb神经元中VGLUT2 mRNA上调，咬合异常和焦虑之间的神经传导通路与LHb到Vme的神经元有关。该实验证实了UAC可激活LHb神经元以及牙周本体感受通路，为Vme提供兴奋性输入并使大鼠产生焦虑。这些发现为抑制LHb的活性以减弱TMD的生理和心理影响提供了依据。为了研究ERK(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2和p38在口面部痛觉过敏中三叉神经亚核(Vc)中的作用以及Vc内不同细胞中p-ERK1/2和p-p38(磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38抗体)之间的关系，Jing等[44]采用了Wang等[40]一样的UAC模型，不同的是在建模前将p-p38抑制剂和ERK1/2抑制剂注射入大鼠体内，后在不同时间段测定压力疼痛阈值(pressure pain threshold，PPT)。并通过免疫荧光、Western blot检测ERK1/2和p38的表达。结果显示：从第1天到第7天，UAC模型诱发了颌面部痛觉过敏，PPT值在第3天达到峰值。在此期间，ERK1/2在同侧Vc中被激活，表达量在第1天达到峰值。p-p38也在同侧被激活，表达量在第3天上达到峰值。ERK1/2在神经元中的表达最多，在小胶质细胞中也观察到表达，但表达量较少，而p-p38在神经元和小胶质细胞中的表达几乎相等。U0126(ERK1/2抑制剂)预处理抑制了ERK1/2和p-p38的表达，并抑制了UAC诱导的痛觉过敏。p-p38抑制剂在范围和时间方面产生了类似的效果。综合起来，这些数据表明UAC通过在Vc中的神经元和小胶质细胞激活ERK1/2和p-p38来诱导中枢致敏，从而引起口面部痛觉过敏，从而潜在地影响ERK1/2在p-p38激活期间的作用。为了观察和分析在TMJ-OA的发生发展过程中上机械压力(mechanical pressure，MS)与性激素之间的相互作用，同时利用分子生物学分析发现TMJ-OA病易感基因，阐明TMJ-OA发病的部分机制。Ootake等[45]以C57BL/6J小鼠为实验对象，通过性腺切除加金属板导致前牙反合的方法诱导TMJ-OA。小鼠切除性腺(OX组)后，通过复合树脂将金属板黏接在前牙舌侧，使小鼠前牙咬合错乱(MS组)，4周后处死大鼠。与对照组相比，所有实验组的破骨细胞数量显着增加；番红固绿染色结果显示：ORX(orchidectomy，睾丸切除)+MS和OVX(oophorectomy，卵巢切除)+MS组中从表面到成熟软骨层的软骨细胞数量减少，软骨细胞表面不均匀；MMP-13在软骨细胞中表达量显著上调，与骨形成相关的Collal、Spp1和Bglap的mRNA水平显著降低。笔者认为尽管临床上很少出现单侧前牙反合情况，但UAC模型却提供了证据表明前牙反合在TMJ-OA的发展中有很大作用，并为TMD治疗的研究提供了实验基础，同时Ootake等[45]创建的动物模型可以评估MS、性激素在TMJ-OA发生发展中的作用，还可以研究MS对于性激素在TMD-OA进程中发挥作用的影响。机械方法诱导的错合动物畸形模型效果好、可重复性高、花费少，但它们的病理状态并不能完全等同于人类。当前研究出人类和动物有关于TMD本质上到底有多大区别仍然十分重要，这同时需要花费大量的时间研究。

2.5 结扎丝诱导咬合紊乱模型有研究表明TGF-β1可能在颞下颌关节关节炎的病因学中起关键作用。在Zheng等[46]研究中，使用三种不同的啮齿动物模型TMD大鼠、CED(Camurati-Engelmann，Camurati-Engelmann，卡-恩二氏病)小鼠、老年小鼠，研究TGF-β1信号传导在TMJ-OA进展中的作用，进一步分析以阐明TGF-β1活性的抑制是否会减弱TMJ-OA进展。具体实验方法如下：在第一、二磨牙之间插入直径0.25 mm的正畸结扎丝，在上颌第一磨牙上形成结扎丝结，使TMJ承受异常的机械载荷。该模型早期诱导大鼠产生类OA样改病变如纤维软骨层明显减少，钙化软骨层变薄，软骨退化，伴有蛋白多糖的广泛丢失和软骨细胞总数的减少。在颞下颌关节成分中也检测到与年龄相关的变化，这些都是TMJ-OA患者常见的病理表现。TMD大鼠软骨下骨组织中TRAP阳性细胞数明显增加，Osterix阳性骨祖细胞数(Osterix，特殊蛋白转录家族成员，具有锌指结构，是成骨细胞特异性转录因子，在所有发育骨的成骨细胞和骨细胞中表达，是成骨细胞分化和骨形成过程中所必需的关键物质)明显减少，同时伴有部分软骨下骨丢失。μCT图像显示CED小鼠颞下颌关节软骨下骨量分布不均，提示骨形成障碍。TMD大鼠腹腔注射TGF-β受体抑制剂(TβRI)后，软骨和软骨下骨髓中磷酸化Smad2/3阳性细胞数显著减少，表明TGF-β信号被有效地抑制；值得注意的是，藏红素O染色Mankin评分和OARSI(国际骨关节炎研究协会)评分判定，注射TβRI的TMD大鼠软骨变性得到缓解。此外，注射TβRI后，软骨下骨髓中TRAP阳性细胞百分率明显降低，而Osterix阳性细胞百分率明显增加，骨体积显著增加，提示抑制TGF-β1信号可以减轻TMJ-OA早期的软骨退化和骨吸收。笔者认为Zheng等[46]所进行的科学研究思路清晰，严格遵守科研实验设计的对照原则，使其实验结果更加有说服力，且整个实验严谨、客观、设计合理，可成为有关于TMD-OA相关科研实验的典范。但仍有一些瑕疵，TGF-β1在正常TMJ-OA进程中也会产生，如何排除内源性TGF-β1的干扰，仍需要考虑。

3 不同手术诱导方法及其评价

3.1 关节盘前移位模型内质网应激的软骨细胞凋亡和ECM降解增加，导致软骨完整性丧失。此外，有学者报道，在TMJ-OA的大鼠模型中，ER应激诱导髁突软骨变薄[47]。这些间接证据表明，内质网应激途径与软骨细胞凋亡过程有关，并会诱发OA的进展。然而，目前缺乏直接证据表明ER应激与TMD进展相关。为了研究髁突软骨中内质网应激相关蛋白的表达及其在TMD发展中的潜在作用，Xu等[48]使用外科方法建立成年兔的关节盘前移位模型(anterior disc displacement，ADD)，具体方法如下：兔被麻醉后，沿右侧颧弓制备3 cm切口，暴露颧骨-颞骨鳞部伤口。之后分离出整个颧骨，在颧弓最上缘钻孔，然后用弹性橡胶带将关节盘前部向前拉并固定在孔上。外科模型制备后，可以观察到软骨细胞凋亡数增多，细胞密度下降。ADD组大鼠在手术后1或2周表现出软骨退化的变化，伴有蛋白聚糖的丢失，软骨细胞密度的降低和软骨厚度的减少。种种证据表明ADD的确可作为诱导TMJ-OA的可靠方法。属于HMGB蛋白家族的高迁移率组框2(HMGB2)已被确定为维持人类关节软骨浅表区(SZ)软骨细胞存活的重要转录调节因子。据报道，HMGB2基因的缺失将导致OA样软骨变化，同时HMGB2缺失的小鼠也表现出更严重的早发性OA[49]。因此为了验证HMGB2可以调整软骨细胞的存活率从而参与TMD进程中软骨内压力的刺激传导，Zhou等[50]使用静水压法(hydrostatic method，HP)及ADD法构建SD大鼠髁突软骨细胞的体外模型，HP处理细胞后，β-连环蛋白(一种转录共激活剂，可调节参与细胞增殖和分化的主要基因，在OA软骨细胞中发现总β-连环蛋白水平显著增加，则提示Wnt/β-连环蛋白途径的活化)的mRNA表达降低，而β-连环蛋白的蛋白表达显著增加。HMGB2基因的表达上调，其表达调节了软骨发育相关因子Col-Ⅱ、MMP13和β-连环蛋白的表达。在兔模型中的结果还发现，ADD处理后，HMGB2和β-连环蛋白的表达增加。Col-Ⅱ的表达随着静水压的增加而增加。且在实验期间，术后所有动物体质量没有明显变化。ADD组实验兔中，1～2周时可以观察到组织学TMJ髁突软骨变薄和细胞排列紊乱，组织学评分中部分软骨表面结构缺失。一些髁突软骨在4周时恢复其厚度。所有ADD组的兔子的髁突软骨细胞逐渐重新排列，并且在8周时厚度增加到正常水平，表明软骨形成加速。笔者认为ADD手术法要在颧骨上方切开一个切口，并需要颞骨鳞部颧骨连接处造成骨折，手术方法本身就对结果产生影响，这是该模型的局限性。而HP处理软骨细胞后可能会影响β-连环蛋白的核易位，从而导致mRNA和蛋白质表达水平之间的差异，如何提高HP诱导的稳定性仍是需要改进的地方。

3.2 关节盘切除及穿孔模型IL-37是一种新型抗炎细胞因子，是IL-1家族中新发现的成员，可抑制炎症及免疫反应[51]。尽管学者们对IL-37进行了孜孜不倦的研究，但对于IL-37及其变异体在软骨细胞中的分布却鲜有报道，关于IL-37对炎症信号通路的影响更是知之甚少。Luo等[52]为了研究IL-37及其变异体在软骨细胞中的表达以及IL-37在炎症期间如何影响软骨细胞。以SD大鼠为研究对象，通过手术方法制造TMJ-OA模型：沿颧弓做一斜形切口。然后，暴露颞下颌关节上间隙，从关节盘的后外侧拉出关节盘，并使用直径1.5 mm的钻头造成穿孔模型。结果示：手术组中，Safranin O显色观察到蛋白聚糖损失，软骨着色大大减少，髁突软骨变薄，形状扁平，发生侵蚀和硬化；免疫组化结果表明Ⅰ型胶原(COLI)和Ⅱ型胶原(COLII)表达下调；MMP1、MMP9和MMP13表达显著上调。关节盘穿孔术结果显示大鼠产生了TMJ-OA样变化。TOLL样受体(TLR-4)是模式识别受体的一种，其主要位于细胞膜上，可参与先天性免疫反应[53]。软骨细胞、滑膜细胞等可以在应激状态下激活TLR-4，从而诱导炎症介质产生。在关节软骨病变和膝关节OA滑膜中检测到TLR2和TLR4表达上调，与正常软骨相比，OA患者软骨中TLR2、TLR3、TLR4和TLR5的高表达均得到证实，验证了Toll样受体(TLRs)在OA进展过程中先天免疫反应中的作用[54]。为了研究在关节盘切除术后实验兔促炎和分解代谢介质表达的改变，以及使用TLR-4抑制剂后，TLR-4在TMJ-OA发生发展中的作用。Liu等[55]以C57BL/6J小鼠为实验对象，使用了Lan等[56]的方法：在实验兔的右侧TMJ上做一个“T”形切口，随后通过钝性分离暴露关节，取出整个关节盘，构建了关节盘切除模型，部分实验动物在造模前，提前注射TAK-242(TLR-4抑制剂)。在造模后的第2周、第4周、第6周分别取材送检。关节盘切除组与对照组相比，髁突中软骨变薄，未矿化骨区域增大，软骨细胞减少；TLR4表达量逐渐升高，还发现软骨中表达TLR-4的细胞比率与OA评分呈正相关；Micro-CT显示：TAK-242注射显著改善了颞下颌关节关节盘切除术诱导的软骨蛋白聚糖的减少；免疫组化结果显示：在手术6周后，软骨中促炎介质(IL-1β、TNF-α)和分解代谢介质(ADAMTS5，MP13)的表达均上调。学者们进行的实验研究已经发现了软骨内骨化的核心机制，遗传学研究提供了颞下颌软骨内形成期间以及长骨生长板和骨折愈合过程中软骨细胞直接分化为成骨细胞和骨细胞的证据。然而，软骨细胞向成骨细胞/成骨细胞转化的具体机制尚不清楚[57]。为了研究这些问题，有学者在尤卡坦小型猪中使用关节盘穿孔模型通过手术诱导TMJ-OA，具体步骤如下：在颧突上方形成斜形切口，使组织抬高并回缩进入颞下颌关节上间隙，关节盘向后牵引，使用打孔器在颞下颌关节关节盘的后外侧部分形成5.0 mm的穿孔，对照组为假手术组[58]。术后4周处死动物进行组织学评估，在实验组和假手术组中均测量Ⅱ型胶原阳性成熟区(MZ)与Ⅰ型胶原浅表区(SZ)的厚度。两组动物关节盘COLlal和Acan表达均为阳性，进一步证明，与假手术对照组相比，实验组模型中髁突软骨厚度和细胞成熟区结构发生改变。组织形态计量学分析显示，实验组SZ区域较假手术组明显增厚，提示髁突软组织扩张。HE染色显示实验组小猪髁突还伴有软骨细胞外基质的大量丧失，这些数据与其他研究表明：软骨细胞标志物和成骨细胞/骨细胞标志物在颌骨生长和骨折愈合的软骨向骨转化过程中存在共定位现象，并为小型猪颞下颌关节损伤模型中软骨向骨转化提供了证据。关节盘穿孔的小型猪TMJ髁突软骨内CD31+内皮细胞数量的增加表明血管生成在TMJ-OA病理学机制或修复中起着关键作用。此外，与假手术组相比，关节盘穿孔组髁突浅表区中的脉管束的数量也更丰富。笔者认为虽然手术方法可很好地保存关节囊和关节附属结构，在某种程度上保留了关节机构的完整性，但仍然与人TMD的发生、发展有相当大差别。大多数外科方法都可用于大型动物上，并不能广泛地应用于小型动物，同时手术对于关节结构的破坏有可能会干扰TMD的自然进程。

4 不同基因工程动物及其评价

4.1 Prg4(蛋白聚集多糖)基因缺失小鼠蛋白聚糖4(Prg4)基因编码润滑素是一种黏蛋白样分子[59]，Prg4与透明质酸相互作用，并将其集中在关节表面，使关节具有较低的摩擦系数，保护关节软骨免受摩擦引起的损伤[60]。除此之外，Prg4作为一种黏液糖蛋白，还可以抑制软骨细胞凋亡，对软骨细胞起到保护作用，是一种维持关节稳态所必需的细胞外基质分子。Bechtold等[61]使用了Matthew Warman博士提供的转基因小鼠，报道了Prg4缺失的小鼠颞下颌关节组成结构中异位软骨数量更多，Prg4基因缺失小鼠在第3个月时，TMJ显示出明显的OA变化，包括关节窝顶部和关节盘厚度增加，与年龄匹配的对照组相比，髁突头略有扩大，骨赘样软骨从关节窝的关节面中央部分开始生长，并生长到上关节腔。同时，关节盘有异位软骨发生，这些多余的组织似乎与相对的骨赘相连。12个月后，OA样改变加重。矢状面、鸟瞰图和正视图显示，与对照组髁突相比，沿近侧方和前后方向的髁突均增大，显示出OA样变化，包括多孔骨表面、骨赘及骨面扁平和凹陷。在Prg4基因缺乏小鼠关节盘的内侧和外侧也检测到钙化组织，并与髁突周围骨赘的发展密切相关。对3～12个月龄Prg4基因缺失型小鼠进行的颞下颌关节骨赘/异位软骨发育的组织形态计量学观察表明，异位软骨和骨性改变首先发生在关节窝和髁突，随后在关节盘中形成异位软骨。笔者认为Prg4基因缺乏小鼠能够较完美地再现TMJ-OA的相关表现，有利于从病因学、病理生理学机制、临床表现等方面去更加深入地理解TMD，Prg4基因缺失小鼠的出现为研究TMJ-OA的早期发病机制和关节功能障碍提供了一个独特而有价值的模型，可为日后研究TMD治疗相关药物打下坚实的基础，但Prg4基因缺乏小鼠为什么会有OA样表现，其潜在的重要致病转化背后的分子机制尚不完全清楚，且小鼠和人的关节软骨的结构不尽相同，动物实验结果能否外推到人类身上，仍存在争议。

4.2 MRAS基因无效突变动物模型MRAS基因(肌RAS癌基因同源基因)已被证明在细胞发挥功能过程中起着许多作用，例如分化、细胞骨架重塑和细胞迁移，该基因编码属于RAS家族的小型单体GTP酶，控制多种信号通路，如MAPK和PI3K-AKT级联等[62]。Smith等[63]将MRAS基因无效突变鼠分为纯合型、杂合型，分别在模型小鼠上使用校准的von Frey尼龙单丝，采用Dixon升降法评估戒断阈值。将细丝贴在后爪足底表面3 s，记录反应。每只小鼠注射20 mL CFA，在基线前(注射CFA前1 d)和注射后3 d、7 d、10 d、14 d和21 d，使用von Frey纤维对小鼠进行机械敏感性测试量化机械性痛觉异常。比较了纯合型、杂合子和野生型小鼠后爪注射CFA引起的机械超敏反应，所有组在第3天都表现出对Von Frey纤维刺激的戒断阈值降低，到第21天就消失了[63]。CFA注射前的基线机械阈值和注射3 d后观察到的最大机械痛觉超敏的基因型差异均无统计学意义。在炎症性疼痛模型中，携带MRAs(肌肉RAS癌基因同源)无效突变的雄性小鼠表现出持续性机械性超敏反应。遗传学和行为学研究表明，即基因决定的MRAS的表达有利于减轻TMD疼痛反应，这种效应是雄性特有的，这可能是导致男性颞下颌关节紊乱病综合征患者疼痛发生率较低的原因之一。

4.3 TNF-α受体基因缺失小鼠动物模型TNF-α受体基因具有多态性，反应性关节炎和类风湿性关节炎患者通常具有遗传和微环境因素的综合病因。Mcllwrath等[3]通CFA+结肠激惹双重诱导TNF-α受体(R1/R2)基因缺失小鼠，来分析判断不同野生型、突变型小鼠在同样刺激下的炎症表现。结果表明在缺乏TNF-α信号的情况下。功能性TNFR1/R2的缺乏诱导促炎细胞因子的增加和抗炎细胞因子的减少从而产生异常的炎症信号。笔者认为Mcllwrath等[3]进行的实验有利于发现TMD发病过程中TNF-α受体所发挥的作用，以及由其所介导的表达增加的致炎细胞因子种类，从而将这些胞因子可以作为血液生物标志物并可以预测疾病的进展，并可将针对TNF-α受体相关药物作为治疗TMD的新目标。但与此同时，该实验仍具有缺点：福尔马林诱导仅在雄性大鼠身上进行，无法排除性激素对该实验的影响，用于测量大鼠离断机械阈值的方法会导致测量在结果在雄性动物和雌性动物之间存在不同，从而掩盖了超敏反应本身所存在的性别差异。

4.4 K/BxN类风湿性关节炎小鼠类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病，以慢性关节炎症(关节肿胀、僵硬和疼痛)为特征，常伴有关节外其他表现。全世界约有1%的人口罹患此病，类风湿性关节炎患者常常伴有其他合并症(如心血管疾病)[64]。尽管学者对RA动物模型进行了大量的科学研究，但仍然缺乏青少年期的小鼠RA动物模型。在1996年，有学者报道了KRN转基因动物与非肥胖型糖尿病小鼠(non-obese diabetic mice，NOD)杂交从而得到K/BxN小鼠，它们会出现严重的膝关节炎和骨骼破坏表型。这种动物模型是通过将K/BxN小鼠的血清(含有高水平的自身抗体)转移至在正常的野生型小鼠体内，从而诱发进展迅速的、表型一致的关节炎症[65]。IL-6和TNF-α既是治疗类风湿性关节炎患者中参考的药物靶点，同时也在K/BxN小鼠的关节中过表达。实验结果显示针对于Col-1、Col-2和蛋白多糖的组织学检测和免疫荧光检测表明K/BxN动物的颞下颌关节出现软骨损伤，MicroCT结果也证实了这一点。Micro-MRI观察表明上关节腔体积增加。同时分离于TMJ小鼠的成纤维细胞样滑膜细胞可分泌炎性细胞因子(IL-6和IL-1β)，并表达MMPs等降解介质。笔者认为K/BxN动物模型与人类类风湿性关节炎具有临床相关性，整个致病过程是自发的和渐进的，逐渐演变为慢性炎症，并呈现对称分布和联合破坏的特点，是探索和研究TMJ自发性损害的一个重要模型。

4.5 Fas基因缺陷的MRL/LPR小鼠模型MRL/LPR小鼠是由LG、AKR、C3H和C57BL/6几种不同品系小鼠经过一系列杂交至12代所得，在第13代时，筛选出淋巴增生反应阳性和阴性的亚系，它们有89%的基因组是相同的。突变基因Faslpr位于19号染色体上，将突变基因导入到其他品系中，即可产生具有不同免疫缺陷疾病表现的新品系，如MRL/MPJ-Faslpr、B6.MRL-Faslpr/j等[66]。而颞下颌关节关节软骨易受到自身免疫性疾病、骨关节炎和类风湿性关节炎的侵袭，其中比较常见的就是类风湿性关节炎，其一大特点是软骨下松质骨转换增强，它是骨吸收和骨形成活动失衡的结果。迄今为止，类风湿性关节炎中破骨细胞形成和分子活化机制仍不清楚，为了研究介导骨吸收的破骨细胞的形成和激活过程，Hutami等[67]研究出了一种Fas基因缺陷的MRL/LPR小鼠模型，该模型自发性地发展成自身免疫性关节炎，特征是炎性细胞浸润、骨质疏松表型以及骨和软骨组织的破坏。NF-κB信号是许多慢性疾病发生的信号中心，包括关节炎、动脉粥样硬化、糖尿病和炎症性肠病。同时，多肽SN50已被证明可以穿过细胞膜并阻断NF-κB复合体的核转位的小肽从而阻止NF-κB的激活，与NF-κB复合物竞争核转位，阻断NF-κB信号通路[68]。1-磷酸鞘氨醇受体1(S1P1)是破骨细胞前体从循环中排出进入骨组织所必需的，在S1P1诱导破骨细胞前体细胞迁移和通过rac1向下游传递信号过程中发挥着无可替代的作用。MRL/LPR小鼠髁突组织体外培养可发现破骨细胞活性增强，且下颌骨髁突由于骨吸收严重导致软骨下骨丢失。实时荧光定量PCR结果显示破骨细胞标记物如TRAP、组织蛋白酶K、RANKL、VEGF和MMP-9的表达均上调[69]。人工合成的NF-κB抑制肽SN50应用于MRL/LPR小鼠时，软骨下骨小梁丢失减少，破骨细胞生成标志物的产生和鞘氨醇激酶(Sphk)1/S1P1信号转导均减少。结果表明，激活破骨细胞前体细胞中的Fas/S1P1信号是颞下颌关节类风湿性关节炎发病机制中的一个关键因素,靶向NF-κB的p50或p65亚单位可能是抑制破骨细胞活性治疗颞下颌关节类风湿关节炎的有效途径。笔者认为Fas基因缺陷的MRL/LPR小鼠提供了一种自发表现与人类RA特征相似的疾病动物模型。然而，介导MRL/LPR小鼠RA发展和骨吸收的机制尚不清楚。同时由于人类TMD发病的多因性和复杂性,单独应用MRL/LPR小鼠模型不能完全揭示人类TMD发病原因和病理机制，常常需要联合其他动物模型才能更好地揭示TMD的病理表现和发病机制。同时Hutami等[69]仅仅在细胞层次对MRL/LPR小鼠进行研究，如后续实验能增加其动物学表现及病理学研究，将使实验结果更加具有科学性和说服力。

5 展望

随着人类社会的不断发展进步，无论是生物学、药学、医学、还是毒理学的需要，任何服务于人类科学研究的实验都不可避免地要开发、研究和验证动物模型。怎样选择合适的实验动物来模拟人类疾病的发病过程、病理改变、临床表现是重中之重。如果缺乏一个稳定的、适合的、便利的实验动物模型，那么可以说想得到可靠的、能信服于人的实验结果简直是天方夜谭。同样将结果外推到人类身上更加难以实现。颞下颌关节紊乱病相关动物实验研究滞后于临床研究，如何设计出可靠的、稳定的实验动物模型也是每位学者都应着重解决的问题。构建颞下颌关节紊乱病动物模型的方法各式各样，可供选择的动物种类繁多，如何选择正确的TMD动物模型，在未来的TMD相关研究中一定会被解决，随着相关实验的进展深入和相关文章的陆续发表，未来的TMD学科研究、动物研究、治疗方法研究必将会更上一层楼，成为口腔医学领域和动物实验学研究的热点，从而为TMD的病因学研究、病理机制研究、临床表现、治疗和预防提供坚实的实验基础，以有利于发现治疗TMD的有效方法，为广大TMD患者解除病痛。