间作对连作葡萄生长及根际环境的影响

朱绍坤，孙凌俊，高圣华，乔军，郭荐硕

（1. 辽宁省果树科学研究所，辽宁营口 115009；2. 辽宁农业职业技术学院，辽宁营口 115009）

葡萄是世界重要水果之一，在世界范围内种植广泛，目前中国鲜食葡萄的产量与面积已居于世界第一[1]。葡萄产业在辽宁农业中占重要地位，截止2020年葡萄栽培面积已达4.48万 hm2，产量90.60万 t，分别占全国葡萄的5.5%、6.5%，位居全国第五位和第四位。但辽宁省作为葡萄老产区，随着种植年限的增加，葡萄连作引起的病虫害加重、树体衰弱、再植更新困难等问题，降低了葡萄品质与产量[2]，影响了果农经济效益，阻碍了葡萄产业的可持续发展[3]。

研究发现，间作已经成为缓解连作障碍的有效措施之一，合理间作能促进植株生长[4]，提高作物产量[5]，降低病害发生率[6]，显著改善土壤微生物的种群结构[7-8]。胡国彬等[9]研究发现，蚕豆与小麦间作使蚕豆的籽粒产量和百粒质量分别提高44.29%和12.17%，枯萎病病情指数降低57.14%。郑亚强等[10]研究发现，玉米间作甘蔗使根际微生物功能多样性提高，根际微生物活性增强。目前关于果树间作的相关研究多集中在根系、水肥、光照的空间分布与利用等方面，涉及间作对连作果树根际环境影响等方面的研究仍需深入和系统化。

葡萄育苗圃是连作危害较重的地块之一，本研究基于前期试验结果[11]，选取3种作物与‘贝达’葡萄间作种植，研究不同间作物对连作葡萄生长、根际环境的影响及其相互关系，探讨葡萄间作系统中根际土壤养分、微生物群落结构等的变化规律及影响因素，旨在为连作葡萄间作效应的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材为一年生‘贝达’葡萄扦插苗，间作物为大葱（C）、花生（H）、苦荬菜（K），种子购自农发源种子公司。试验地点位于沈阳农业大学葡萄试验园，该园建立于1978年，期间对葡萄更新3次，供试连作土壤基本理化指标为：碱解氮为98.35 mg·kg-1、速效磷109.44 mg·kg-1、速效钾189.8 mg·kg-1、有机质26.53 g·kg-1、pH为6.85。

1.2 试验设计

采用槽式栽培方式（80 cm×65 cm×70 cm）。将栽于连作土中的‘贝达’分别与3种间作物定植，间作物与葡萄的行距分别设为5、10、15、20、25 cm， 共5个处理。葡萄苗株距为10 cm，两侧为作物种植行，间作物株距为7 cm，以不间作的葡萄苗为对照（CK）。葡萄单臂篱架，避雨栽培，常规统一管理。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄生理指标测定

间作种植80 d（此时植株生长趋于平缓）后取葡萄植株测定地上部、地下部的鲜质量。

1.3.2 葡萄根际土壤的收集

用抖根法[12]收集葡萄根际土壤，混匀后统一过20目筛。一部分风干保存，用于理化性质测定；另一部分保存于﹣80 ℃，用于微生物结构测定。

1.3.3 葡萄根际土壤理化性质的测定

碱解氮采用碱解扩散法测定，速效磷采用钼锑抗比色法测定，速效钾采用火焰光度计法测定，有机质采用重铬酸钾容量法测定，pH值用pH测量仪测定[13]。

1.3.4 根际微生物结构多样性测定

土壤微生物DNA提取：采用试剂盒方法（生工Ezup柱式土壤基因组DNA抽提试剂盒）。细菌扩增采用968-GC-F和1401R[14]为引物扩增16S rDNA序列；真菌采用巢式PCR扩增，分别以ITS1F/ITS4[15]和ITS1-GC-F/ITS2[16]为第一轮和第二轮扩增引物。

PCR反应条件：第一轮条件为94 ℃变性7 min；94 ℃变性60 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循环32次；最后72 ℃延伸15 min。取10 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若均为清晰条带进行第二轮扩增。第二轮条件为94 ℃变性7 min；94 ℃变性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循环32次；最后72 ℃延伸15 min。琼脂糖电泳检测出现清晰条带后，可进行变性梯度凝胶电泳。

变性梯度凝胶电泳所用变性梯度细菌为40%～60%，真菌为30%～60%，采用8%聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为1×TAE，用微量注射器每孔上样40 μL，60 ℃下180 V电压运行6 h，电泳完成后用Genefinder染料进行避光染色30 min，用凝胶成像系统拍照。

1.4 数据分析

采用化感效应指数（RI）分析生理指标，即

其中，T代表处理值，C0代表对照值；RI为正值表现促进，RI为负值表现抑制。

采用Quantity One软件分析DGGE的指纹图谱数据，用Shannon指数表示土壤微生物种群多样性；H´= ﹣∑pi×㏑pi，其中pi为某一条带密度占该泳道所有条带密度之和的比值。

采用Excel 2010、SPSS 20.0软件进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 间作对连作葡萄生长的影响

间作物对连作葡萄植株鲜质量的化感效应指数如图1。间作大葱处理对连作葡萄长势的影响，除C5处理表现为抑制作用外，其他处理均增加植株总质量，促进作用随距离的增加呈现先增强后降低的趋势，其中C20处理促进作用最强；在间作花生处理中，间作5 cm处理呈现抑制作用，而10 cm处理具有明显的促进作用；间作苦荬对葡萄质量均表现为抑制，K5处理抑制效果最强。

图1 不同间作处理对葡萄总质量的影响Figure 1 Effects of the intercropping treatments on total mass of grape plants

2.2 间作对连作葡萄根际土壤理化性质的影响

根据对不同间作模式下葡萄根际土壤理化性质的测定结果（表1），可得出间作大葱对各理化性质的影响，其中碱解N（C10除外）、速效P（C10除外）、有机质（C5除外）、pH（C5除外）与CK相比均无显著性差异，而速效K（C15、C20除外）有降低的趋势。与CK相比，间作花生处理降低了碱解N、速效P（H25除外）含量，提高了有机质含量（H5除外）；速效K中H5显著高于CK，H15、H20显著低于CK。苦荬处理中速效K（K5、K15除外）、pH值（K10、K20除外）显著低于CK。

表1 不同间作模式对葡萄根际土壤理化性质的影响Table 1 Effect of intercropping treatments on physical and chemical properties of grapevine rhizophere soil

土壤肥力是土壤中各种理化性质的综合反应，为评价不同间作模式下土壤理化性质综合水平，将土壤养分指标进行主成分分析。其中，第一主成分方差贡献率为48.67%，特征值为2.44；第二主成分方差贡献率为21.92%，特征值为1.10。两个主成分累计方差贡献率达到70.58%，基本包含了主要土壤理化信息。

由表2可知，各间作处理土壤肥力综合得分整体低于不间作处理；间作苦荬土壤养分综合得分（除K5）高于间作大葱；间作花生土壤养分综合得分较低。

表2 主成分因子得分及土壤肥力水平综合得分Table 2 Principal component factor score and comprehensive score of soil fertility level

2.3 间作对连作葡萄根际微生物结构多样性的影响

通过PCR-DGGE分析不同间作处理对葡萄根际细菌和真菌结构多样性的影响，如图2。各间作处理降低了连作葡萄根际细菌结构多样性，且间作苦荬处理对细菌多样性的降低程度大于间作大葱、花生处理。在间作大葱模式下，微生物细菌多样性为C20＞C25＞C15＞C10＞C5；间作花生处理中，随间作距离的增加多样性呈现低-高-低的趋势；在苦荬间作中，各间作处理细菌多样性差异不明显。

图2 葡萄根际微生物结构H'值Figure 2 The Shannon index on the structure of the rhizosphere microorganism in grapevines

如图2所示，间作降低了根际土壤真菌的多样性，间作苦荬处理的真菌多样性受抑制程度低于间作大葱、花生处理。在间作大葱模式中，C25微生物中真菌多样性抑制程度最低，C15真菌的抑制程度最高；间作花生处理下，H25处理对根际真菌多样性降低程度最高，H10、H15处理降低幅度较低；而间作苦荬中，真菌多样性表现为K5＞K25＞K20＞K10＞K15。随间作距离的增加，真菌多样性受抑制程度表现为先增加后降低的趋势。

图3 为各间作模式下根际细菌与真菌结构多样性比值，均无显著性差异。间作大葱、花生中细菌与真菌比值高于CK，苦荬间作处理的细菌与真菌比值小于CK。间作大葱中，C20处理比值最高；花生处理中H10、H15处理的比值较高；间作苦荬处理中K5比值最低。

2.4 间作葡萄根际微生物结构多样性与植株长势、土壤理化性质相关性分析

通过对葡萄根际土壤微生物细菌、真菌多样性比值与各处理葡萄植株总质量间的相关性分析发现，细菌、真菌多样性比值与葡萄长势（即总质量）间相关系数为0.901，存在极显著正相关性。

通过对不同间作处理下葡萄根际微生物结构多样性与各组分土壤理化性质进行相关性分析发现（表3），细菌的结构多样性与根际土壤pH值间存在显著相关性，真菌的结构多样性与土壤碱解氮含量间存在显著相关性。

表3 根际微生物结构多样性指数与土壤理化性质相关性分析Table 3 Correlative analysis between the Shannon index of the microbial structure and the physical and chemical properties in rhizosphere soil

3 讨论

3.1 间作对连作葡萄生长的影响

间作被认为是农业生产方式中的精华，不仅是一种高效的种植模式，而且有抗病、增产等优势[17-18]。间作可优化根际土壤生物多样性及群落组成[19]，显著提高微生物总数，影响植物长势[7-8,20]。本试验发现，间作苦荬抑制连作葡萄植株总质量，而间作花生、大葱提高了连作葡萄植株质量，促进了生长，改善了葡萄的连作障碍，这与前期研究结果一致[11]。

3.2 间作对连作葡萄根际土壤理化性质的影响

根际土壤环境在连作中占据极其重要的位置[21]，土壤养分、微生物及植物之间相互作用，共同维持着土壤环境[22]。本研究发现，间作苦荬、花生、大葱对根际土壤理化性质的影响无明显规律性，但主成分分析表明，3种间作物均降低了根际土壤肥力水平。推测可能是间作物与葡萄之间存在部分养分竞争关系或部分作物间作后产生种间促进作用，提高了葡萄对土壤养分的吸收利用，从而降低了根际土壤肥力。这一推测与Li等[23]的研究相似，其发现蚕豆玉米间作后，蚕豆和玉米均增加了对土壤养分磷的吸收，且蚕豆和玉米分别增产26%、43%。

3.3 间作对连作葡萄根际微生物结构多样性的影响

目前的研究普遍认为，连作障碍发生的重要原因是根际微生物群落失衡，由细菌型向真菌型转变[24]，而间作可使土壤向健康的“细菌型”转变[25]。本试验通过微生物结构多样性研究发现，间作大葱、花生土壤中细菌与真菌的比值高于对照，而间作苦荬处理其比值低于对照，并发现细菌与真菌结构多样性比值与葡萄植株长势（即总质量）具有极显著相关性，说明合理间作可提高土壤细菌比例，并可通过提高葡萄根际土壤细菌与真菌的比例，改善葡萄连作障碍。

3.4 间作葡萄根际土壤微生物与理化性质间的关系

前人研究表明根际土壤理化性质与微生物之间存在相互作用[26]；微生物多样性受土壤理化性质变化的影响[27]，而土壤理化性质保持平衡的因素之一是微生物的多样性[28]。李巧玲等[29]研究发现，pH在细菌群落多样性中发挥着重要功能；而碱解N与土壤微生物多样性呈显著相关性[30]。本研究得出，根际土壤中细菌、真菌多样性分别与土壤pH值、碱解氮存在显著相关性。该结果证实了前人的研究，认为土壤理化性质中的碱解N与pH值在间作葡萄根际微生物结构多样性中发挥着重要作用。

4 结论

间作大葱、花生对连作葡萄长势有促进作用，间作苦荬对连作葡萄有抑制作用。间作可以改变连作葡萄的根际土壤环境。间作大葱、花生、苦荬降低了葡萄根际土壤肥力；间作大葱、花生提高了根际土壤细菌与真菌结构多样性比值，间作苦荬降低了其比值；根际土壤细菌与真菌结构多样性比值与连作葡萄植株长势具有极显著相关性。因此认为，间作大葱、花生通过提高根际土壤细菌与真菌结构多样性比值，从而对葡萄连作障碍缓解发挥重要作用。