三七种植土壤中对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌的化感作用

2023-03-31万琼莲王占娣王连春

西南农业学报 2023年1期

赵静,万琼莲,焦蓉,王占娣,王连春

(玉溪师范学院化学生物与环境学院，云南红塔 653100)

【研究意义】三七[Panaxnotoginseng(Bruk)F.H.Chen]是五加科人参属植物，分布于中国云南省东南部，生于海拔1200～1800 m地带，广西省西南部亦有栽培。三七性喜温暖阴湿，其独特的生长环境易诱发多种病害，随着其种植面积的不断扩大及连作障碍的制约，三七种植中病虫害问题成为制约三七生产的重要因子，随着种植时间的延长，发病程度日益严重。三七病害的发生是三七—土壤—土壤生物整个生态系统综合作用的结果，查明三七根系分泌物对土壤微生物化感效应的影响，是减轻或解决三七种植中病害发生的关键问题。【前人研究进展】随着连作年限的延长，根腐病发病率增加最为明显[1]。引起三七根腐病的病原有真菌性病原也有细菌性病原，其中以镰刀菌型根腐病最为多见。因此，镰刀菌属真菌为三七根腐病的主要病原菌。阮兴业等[2]认为，三七根腐病的主要病原菌为腐皮镰刀菌[Fusariumsolani(Mart.)Sacc.]。王拱辰等[3]研究认为，三七根腐病除腐皮镰刀菌外，还有尖孢镰刀菌(F.oxysporumE.F.Sm.& Swingle)和串珠镰孢中间变种(F.monilliformevar.intermedium Neish & M.Legg)。其中，以尖孢镰刀菌(F.oxysporumE.F.Sm.& Swingle)最为多见。根腐病的发生与连作条件下植物根系分泌物对病原菌的化感作用有密切关系。Shahzad等[4]指出，根系分泌物是植物促进土壤有机质矿化的主要途径。植物通过其分泌物不仅为土壤微生物提供能量，而且似乎同时控制着能量的使用方式。对羟基苯甲酸为酚酸类化感物质，是自然界中常见的化合物，存在于高等植物、微生物、苔藓和土壤中。酚酸类物质是产生作物连作障碍的主要因素，它可以直接或间接的促进或抑制微生物群落，进而影响作物生长。【本研究切入点】实验室前期研究结果表明，对羟基苯甲酸为三七重茬土壤中含量较高的三七根系分泌物，实验室条件下，对羟基苯甲酸浓度为5.0 mmol/L时最有利于尖孢镰刀菌生长[5]。但该浓度与自然生理状态下土壤中的浓度是否相符？对羟基苯甲酸与尖孢镰刀菌之间的相关性如何？目前尚未见系列报道。【拟解决的关键问题】本研究采集了三七道地产区云南省文山州种植地区不同种植年限的三七根系土壤，采用HPLC技术、宏基因组学技术，结合酶学研究方法，分析对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌的化感作用，从而为由尖孢镰刀菌引起的三七根腐病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤的采集土样采集于三七道地产区云南省文山州的砚山地区，位于云南省东南部、文山州中西部(23°23′N，103°30′E)。选取三七种植年限分别为1年(处理T1)、2年(处理T2)、3年(处理T3)的地块，利用五点取样法，在每块种植田4个角落及中心点选取共计5个采样点，采集三七根系周围5 cm范围内土壤，分别以1年生[处理T1(CK)]、2年生[处理T2(CK)]、3年生[处理T3(CK)]种植地块周围未种植过三七的土壤为对照。

1.1.2 病原菌菌株尖孢镰刀菌为玉溪师范学院滇中道地药材研究重点实验室分离，并通过接种实验、生理生化性状及分子生物学鉴定确定的尖孢镰刀菌三七专化型菌株(F.oxysporumE.F.Sm.& Swingle)。

1.2 土壤中对羟基苯甲酸含量测定

1.2.1 土壤中对羟基苯甲酸粗提液的制备将采集的土壤过24目筛，除去样品中三七根须、残枝落叶等杂物。取土10 g用氢氧化钠1 mol/L溶解，超声震荡30 min后静置24 h，离心机离心20 min(8000 r/min)。取上清液，用HCl 12 mol/L调节pH 2.5，超声震荡10 min，静置2 h后，用离心机离心10 min(8000 r/min)，取上清液，用相同体积的乙酸乙酯萃取3次，每次30 min，保留乙酸乙酯。最后将3次所得乙酸乙酯混合，用旋转蒸发仪45 ℃蒸干，剩余最后1～2 mL时，停止蒸发，用80%甲醇2 mL 溶解，过0.22 μm滤膜，上机测试。

1.2.2 HPLC仪器条件色谱条件：spursil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.8 mL/min；上样量：20 μL；流动相：磷酸二氢钾25 mmol，调节pH 2.5；检测波长，210 nm。

1.3 土壤中真菌群落结构的分析

土壤总DNA的提取参照赵静等[6]的方法进行。利用通用引物扩增真菌NS1-FUNG通用引物标签序列，序列扩增、纯化、均一化参照Rodrigues等[7]的方法。土壤真菌宏基因组序列的测定及数据的分析，参照赵静等[6]的方法进行。

1.4 对羟基苯甲酸胁迫下尖孢镰刀菌的生长及酶活性分析

1.4.1 菌株的处理将活化后的尖孢镰刀菌菌株分别接种于含有1.0(处理1)、2.5(处理2)、5.0(处理3)、7.5(处理4)、10.0(处理5)、50.0(处理6)mmol/L的对羟基苯甲酸PDA培养基中，于25 ℃下培养，以不添加对羟基苯甲酸的PDA培养基为对照[处理0(CK)]。

1.4.2 菌落生长情况测定将上述菌株分别培养24、48、72 h观察菌落的生长情况，采用直尺测定菌落直径(cm)，并观察菌落的颜色及菌丝的致密度。

1.4.3 产孢量的测定采用血球计数平板法，灭菌的纯净水2 mL冲洗培养72 h后的真菌平板，收集液用纯水定容至2 mL。取上述孢子悬浮液100 μL，利用血球计数器计数，并按照下式计算平板上孢子总数。

孢子总数=A/5×16×B×104

式中，A为血球计数器方格中的总菌数；B为稀释倍数20。

1.4.4 酶活性分析水解酶(果胶酶、纤维素酶)的测定，参照Wu等[8-10]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 三七不同种植年限土壤中对羟基苯甲酸含量测定

由表1可见，处理T1(CK)、T2(CK)、T3(CK)的对羟基苯含量分别为3.48、3.95、2.22 mmol/L，这可能是由于取样地虽处于同一个地理区域，但不同地块土壤性状不同导致土壤中对羟基苯甲酸含量不一致。1年生三七土壤(处理T1)中对羟基苯甲酸含量最高，达到5.11 mmol/L，比同一地块未种植过三七的土壤高1.6倍；2年生三七土壤(处理T2)中对羟基苯甲酸含量为3.95 mmol/L，比同一地块未种植过三七的土壤高1.5倍；3年生三七土壤(处理T3)中对羟基苯甲酸含量最低，为2.22 mmol/L，比同一地块未种植过三七的土壤低。从各种植年限土壤样品中对羟基苯甲酸含量与对照样品差异值可看出，随着种植年限的延长，三七根系周围土壤中对羟基苯甲酸增加量呈下降趋势，即种植三七第1年土壤中对羟基苯甲酸含量增加最为显著，第2年降低，第3年下降最为明显，低于对照2.1倍。

表1 三七不同种植年限土壤中对羟基苯甲酸含量及镰刀菌种群密度

2.2 不同种植年限三七根际土壤真菌群落结构分析

由图1可知，不同种植年限的三七根际土壤中在属水平上检测出占比水平较高的11类真菌，分别是附球霉属(Epicoccum)、拟层孔属(Fomitopsis)、镰刀菌属(Fusarium)、毛壳菌属(Chaetomium)、轮枝菌属(Verticillium)、枝孢菌属(Cladosporium)、软韧革菌属(Chondrostereum)、盔孢伞属(Galerina)、青霉属(Penicillium)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、拟青霉属(Paecilomyces)。三七种植前后各种植年限土壤样品中真菌群落结构组成及种群密度具有明显不同：1年生土壤样品中，未种植过三七的土壤中主要以附球霉属(Epicoccum)为优势菌种(20.68%)，而种植三七后明显下降(1.56%)，拟层孔属(Fomitopsis)成为优势菌种(38.19%)；2年生土壤样品中，未种植过三七的土壤中主要以附球霉属(Epicoccum)、拟层孔属(Fusarium)为优势菌种，占比分别为22.72%、19.97%，而种植三七后2种真菌种群密度均明显下降，占比分别为9.17%、7.99%；3年生土壤样品中，未种植过三七的土壤中主要以Pottia为优势菌种(43.02%)，而种植三七后明显下降(0.69%)，拟层孔属(Fusarium)成为优势菌种(20.94%)，拟层孔属(Fusarium)取代Pottia成为优势菌种，其占比由2.98%上升到20.94%，增加了10倍，该属真菌主要引起三七根腐病。

图1 不同三七种植年限土壤中真菌群落组成结构特征

结合土壤中对羟基苯甲酸含量的分析可知，当土壤中对羟基苯甲酸含量为2.61 mmol/L时，土壤中镰刀菌种群密度最高，为20.94%。随着对羟基苯甲酸含量的增加，土壤中镰刀菌种群密度下降，当其含量为5.11 mmol/L时，镰刀菌种群密度仅为1.057%。但值得注意的是，土壤中对羟基苯甲酸含量并不是越低越有利于镰刀菌的生长，当土壤中对羟基苯甲酸含量为2.00～3.00 mmol/L，对羟基苯甲酸含量高，镰刀菌种群密度也高。3年生土壤样品中，对羟基苯甲酸含量为2.22 mmol/L，镰刀菌种群密度为19.07%；而2年生对照土壤样品中，对羟基苯甲酸含量为2.61 mmol/L，镰刀菌种群密度为20.94%。

2.3 对羟基苯甲酸胁迫下尖孢镰刀菌孢子及菌落生长分析

由表2可见，与不添加对羟基苯甲酸的处理0(CK)相比，不同浓度的对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌化感作用不同，主要表现为高浓度(7.5～50.0 mmol/L)抑制，其菌落直径与对照相比降低，菌丝生长较为致密；中浓度(2.5～5.0 mmol/L)促进生长，其菌落直径与对照相比升高，菌落颜色在培养24 h既呈现紫色，菌丝生长较对照稍绵密，显微镜下可观察到大量分生小孢子的生成；低浓度(1.0 mmol/L)与处理0(CK)相比，并未显示出明显区别。

表2 对羟基苯甲酸胁迫下尖孢镰刀菌生物量

2.4 对羟基苯甲酸胁迫下尖孢镰刀菌酶活性分析

在2.5～10.0 mmol/L浓度的对羟基苯甲酸处理下，促进了尖孢镰刀菌果胶酶的活性，其中浓度为2.5 mmol/L时，果胶酶活力为1.02 U/(mL·min)。而高浓度的对羟基苯甲酸(50.0 mmol/L)则对纤维素酶活力的刺激作用更为明显，达到最高值1.84 μmol/min。在2.5～10.0 mmol/L浓度的对羟基苯甲酸胁迫下，纤维素酶活力变化不大(图2～3)。

图2 对羟基苯甲酸胁迫下果胶酶活力

3 讨论

3.1 对羟基苯甲酸化感促进尖孢镰刀菌最佳浓度效应值分析

植物根系是植物从土壤中吸收水分和养分的重要组织，在植物的生长过程中，根系也向根际土壤周围释放一些无机离子和有机化合物，这些物质是一类复杂的混合物，是植物连作对根际土壤微生物产生影响的重要媒介之一，参与植物与周围环境的物质交换与信号传递，是根际最为重要的营养和能量来源，也是构成植物不同根际微生态特征的关键因素，这些物质可能成为微生物的营养碳源、氮源或信号刺激物[11-12]。本研究中，三七种植根系土壤中对羟基苯甲酸含量并未随着三七种植年限的延长而增加，反而逐年降低。这可能是由于其刺激了土壤真菌的生长，作为营养物质在真菌的增殖和孢子的萌发过程中被消耗，导致其浓度降低。据文献报道，阿魏酸是地黄根系的主要分泌物，为根际尖孢镰刀菌提供碳源[13]，使病原菌获得充足的繁殖养分，从而使得病原菌数量不断增加，有益的拮抗菌数量减少。而土壤中对羟基苯甲酸含量的逐年降低恰恰更有利于尖孢镰刀菌的生长，这与舒阳[14]及本研究前期研究结果相似，镰刀菌属真菌是三七种植后，土壤中分离最多的真菌属。本研究中，当对羟基苯甲酸含量为2.61 mmol/L时，土壤中尖孢镰刀菌的种群密度最高。

图3 对羟基苯甲酸胁迫下纤维素酶活力

而实验室条件下，2.5～5.0 mmol/L的对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌的化感促进作用最强。该浓度下，尖孢镰刀菌菌落直径最大，产孢量明显增加，且可促进分生大孢子的产生。然而土壤中的对羟基苯甲酸浓度达到3.95 mmol/L时，根系土壤中尖孢镰刀菌含量仅为7.99%，随着对羟基苯甲酸浓度的升高，病原菌种群密度也降低。对羟基苯甲酸浓度为2.5 mmol/L时，镜检可发现大量分生大孢子产生。已有研究表明，尖孢镰刀菌在PDA培养基上一般以产生分生小孢子为主，分生大孢子不与分生小孢子混生[15]。本研究中，不添加对羟基苯甲酸的处理镜检仅见分生小孢子，这说明对羟基苯甲酸可促进尖孢镰刀菌分生大孢子的产生。因此，本研究中对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌的最佳浓度效应值范围应结合土壤含量及实验室条件下的浓度值确定为2.0～3.0 mmol/L。

3.2 对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌致病性的影响

酚酸类物质对病原真菌的化感作用除了诱导增殖外，还可以促进次生代谢物包括毒素、细胞壁降解酶类等的分泌[16]。β-1,3葡聚糖酶、果胶酶、纤维素酶活性影响尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的致病能力[17-19]。果胶酶作为镰刀菌主要的致病性因素，其活性的大小直接关系到植物的发病程度,而纤维素酶活力也影响镰刀菌的致病力[16]。除了这3种细胞壁降解酶外，尖孢镰刀菌(F.oxysporum)中还含有编码内切多聚半乳糖醛酸酶、外切半乳糖醛酸酶、果胶酸内裂解酶以及木聚糖酶基因存在，Jonkers等[20]发现，利用基因敲除技术敲除其中任何一个编码此类蛋白的基因，都会导致尖孢镰刀菌(F.oxysporum)对寄主致病性全部或部分丧失。本研究中，中等浓度(2.5～10.0 mmol/L)的对羟基苯甲酸胁迫下可刺激果胶酶的分泌。而纤维素酶在高浓度(50 mmol/L)的对羟基苯甲酸条件下活性更强。果胶酶、纤维素酶等细胞壁降解酶其分泌量受到微生物碳源、氮源的影响。对羟基苯甲酸在培养基中的添加，增加了碳源，促进了果胶酶、纤维素酶的分泌，结果显示高浓度对羟基苯甲酸促进了果胶酶、纤维素酶活性，这与袁婷婷等[21]的研究结果相似。