巫山脆李褐腐病病原菌鉴定及1-MCP对其的防治效果

张倩倩，何兴兴，熊金梁，彭梦云，黄 明,刘仁鹏,关文强

(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院/天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134；2.重庆市巫山县果品产业发展中心，重庆 巫山 404716)

【研究意义】巫山县是“中国脆李之乡”，巫山脆李又名巫山大李子，属于蔷薇科核果类，因其果肉致密、酸甜可口、风味独特，深受消费者喜爱[1]。然而，脆李果实皮薄，肉质脆嫩，在采收、包装及运输过程中容易受到机械损伤，从而受到微生物的侵染，加剧果实的腐烂。此外，受微生物侵染的果实发病腐烂，又作为病原体感染周围健康的果实，增加果实腐烂率，严重影响脆李商业价值[2-3]。【前人研究进展】研究表明，由病原真菌侵染造成的采后果实腐烂损失比采前更为严重，已报道由真菌侵染采后脆李果实造成的病害主要有褐腐病、黑霉病、炭疽病等[4-5]。其中褐腐病是脆李果实采后贮运过程中的一种主要病害，褐腐病在我国部分省、市均有病害发生及造成大量损失的记录[6]。采后病害的发生对果实品质及产业的发展均造成了不利的影响。目前，核果类果实采后真菌病害的控制主要依靠化学杀菌剂。而过度使用化学杀菌剂不仅会造成环境污染、危害人类健康，还会使病原菌产生抗药性。1-甲基环丙烯(1-methylcyclopropene，1-MCP)作为一种新型乙烯受体抑制剂[7]，具有无毒、无味、安全、环保、稳定性好等特点。研究表明，1-MCP不仅能有效抑制乙烯的产生、延缓果蔬衰老[8]，还能控制果蔬的采后病害，显著降低果蔬采后贮藏期间的腐烂率，其在抑制苹果[9]、草莓[10]、杨桃[11]等多种果实的采后病害方面均有报道。Xu等[12]研究发现1-MCP处理可通过直接抑制孢子萌发和菌丝体生长来控制采后芒果果实炭疽病的发生，降低芒果贮藏期间的腐烂率。陈莲等[13]发现1-MCP处理可诱导青枣果实抗病相关酶活性的上升，增强果实抗病性，有效减轻青枣的病害指数，抑制采后病害的发生，降低果实在贮藏期间的腐烂损失。【本研究切入点】目前，关于巫山脆李采后褐腐病病原菌的分离鉴定及其防控未见报道。对于1-MCP处理在果蔬方面的研究，大多集中在果实贮藏品质方面的影响，鲜见其在脆李褐腐病病害的控制效果方面研究。【拟解决的关键问题】本研究以脆李褐腐病病果为材料进行病原菌的分离鉴定，结合分子生物学技术明确褐腐病病原菌的种类，并采用有伤接种的方式，研究1-MCP处理在不同贮藏温度(4、25 ℃)下对脆李褐腐病的控制效果及果实硬度的影响，以期为脆李采后褐腐病病害的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采集贮藏期自然发病的脆李用于褐腐病病原菌的分离；用于1-MCP对褐腐病抑制效果实验的健康脆李采摘于重庆市巫山县，采摘后当天运回实验室，于4 ℃条件下贮藏待用；选取大小和外观均一、没有机械损伤和明显病害迹象的果实，用75%酒精表面消毒后置于无菌操作台风晾干待用。

PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)由北京奥博星生物技术有限责任公司提供；1-MCP(果蔬保鲜卡)由山东营养源食品科技与有限公司提供。

1.2 病原菌分离纯化

采集发病脆李，装于无菌自封袋中备用。病原菌分离采用组织分离法：首先用75%酒精对自然发病脆李果实进行表面消毒，使用解剖刀先将脆李表皮削去，再从病健交界处切取小块发病果肉组织(5 mm×5 mm×5 mm)，在0.1%次氯酸钠溶液中浸泡1 min，再用灭菌水冲洗，并用无菌滤纸吸干，置于PDA培养基上28 ℃恒温箱中培养。待菌落直径长至2～3 mm时挑取菌落边缘生长旺盛的菌丝体，转移到另一PDA培养基上培养，多次纯化，得到纯化菌种，转入PDA斜面试管，4 ℃冰箱中保存备用。

1.3 病原菌形态学特征观察

将分离纯化的病原菌移接于PDA平板上，观察菌落形态特征，并于光学显微镜下观察病原菌的分生孢子和分生孢子梗形态，测量其大小，结合《真菌鉴定手册》[14]、Lane[15]的方法对病原菌进行初步鉴定。

1.3.1 致病性测定 将健康无病脆李果实先用75%酒精对脆李果实进行表面消毒，用灭菌的铁钉在果实赤道部位打一个孔(直径2 mm、深3 mm)，用打孔器(直径6 mm)将纯化后的病原菌菌饼回接在果实伤口处，将脆李果实置于吸塑盒(17.5 cm×13.5 cm×7.5 cm)中，于25 ℃(湿度条件RH 90%～95%)恒温培养记录发病情况，对发病果实进行病原菌再分离，验证柯赫氏法则。

1.3.2 分子生物学鉴定 将无菌的生理盐水倒入纯化后培养5 d的PDA平板上，将菌丝体悬浮起来，然后用移液枪将悬浮液转移到离心管中，4000 r/min离心10 min，弃去上清液，保留菌体送至上海唯那生物科技有限公司进行PCR扩增实验并测序，采用真菌rDNA-ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系(20.0 μL)：2.0 μL 10 ×TaqBuffer，0.2 μL 5UTaq酶(高保真酶)，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP混合物，引物1、引物2各1 μL，0.5 μL gDNA，13.7 μL双蒸水。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50～90 s，共25个循环；最后72 ℃延伸10 min。电泳条件是1%琼脂糖凝胶，120 V电压电泳30 min。将测得序列结果上传至NCBI网站，利用BLAST软件，对数据库中现有菌株序列进行同源序列比较，判断病原菌种类，并构建系统发育树。

1.4 1-MCP对脆李采后褐腐病的影响

实验采用损伤接种法：用灭菌铁钉在健康果实赤道部位刺一个伤口(2 mm×3 mm)，将分离纯化后的病原菌菌饼(直径6 mm)回接至伤口处，设置4个实验组：①损伤接种病原菌(对照)；②损伤后用1-MCP熏蒸处理24 h再接种病原菌(损伤后经1-MCP处理再接种病原菌)；③先用1-MCP熏蒸处理24 h再损伤接种病原菌(1-MCP处理后接种病原菌)；④先损伤接种病原菌再放入1-MCP熏蒸处理24 h(1-MCP处理前接种病原菌)。

接种病原菌的果实置于吸塑盒(17.5 cm×13.5 cm×7.5 cm)内，湿度条件RH 90%～95%，分别置于4、25 ℃下培养观察，记录果实发病情况，采用十字交叉法测量病斑直径计算发病率。每个处理30个果实，3次重复。

1.5 果实硬度的测定

使用质构分析仪(TA.XT.Plus质构仪，英国SMS公司)和P2圆柱形探头(φ=2 mm)对脆李果实赤道部位等距离进行3次硬度(g)测定。各处理测定18个果实(3个重复)的硬度。参数设置：测试深度10 mm，测试速度为1.0 mm/s。

1.6 数据统计分析

采用Excel 2010和Origin 2017统计分析软件进行数据整理及分析作图，用SPSS 26.0进行Duncan’s差异显著性分析，P< 0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 脆李褐腐病病原菌形态学鉴定

从自然发病的脆李中分离纯化得到的病原菌，其菌丝生长速度较快，菌落边缘较为整齐，其颜色初期呈灰白色，后期变为灰褐色或灰黄色，产孢量丰富，分生孢子丛呈同心轮纹状排列(图1-A)。分生孢子梗具二分枝，顶端分生孢子呈串珠状排列；分生孢子无色、单孢、柠檬形或椭圆形(图1B～C)。结合《真菌鉴定手册》[14]和Lane[15]的褐腐病病原菌形态鉴定方法，初步推测该病原菌为美澳型核果链核盘菌(Moniliniafructicola)。

A:菌落形态;B:分生孢子链; C:分生孢子。

2.2 病原菌致病性测定

果实自然发病初期呈现水渍状褐色圆形病斑，随病害加重，病斑逐渐向外扩展至全果，果实表面出现灰褐色霉粒点(分生孢子)，逐渐堆积形成粉状霉层(图2-A)。接种实验表明，分离纯化得到的病原菌可使有机械损伤的脆李致病，接种24 h即可见褐色病斑(图2-B)，接种后期果实发病特点(图2-C)与脆李褐腐病自然发病症状一致，并且从发病脆李上可再次分离得到与原接种菌株形态大小一致的病原菌，可确定分离纯化得到的单一菌为脆李的致病菌。

A：果实自然发病症状；B：致病性测定发病初期；C：致病性测定发病后期。

2.3 病原菌分子生物学鉴定

经真菌通用引物ITS1和ITS4对病原菌菌株进行PCR扩增，得到一条500 bp左右的条带(图3)，将病原菌的ITS序列结果提交至GenBank中，登录号：OM584290。同源序列比较结果显示，与已报道的美澳型核果链核盘菌(M.fructicola，登录号：MN049476)同源性为100%。用MEGA 7.0软件构建系统发育树(图4)，分离出的病原菌与美澳型核果链核盘菌(MN049476)在同一分枝上。ITS序列分析证明，该病原菌为美澳型核果链核盘菌(M.fructicola)。

T：脆李褐腐病病原菌。

登录号：OM584290。

2.4 1-MCP处理对脆李果实褐腐病发病率和病斑直径的影响

由图5-C1、5-D1可知，25 ℃贮藏条件下，与对照组相比，经1-MCP处理的脆李果实在贮藏初期(24h内)可降低脆李褐腐病的发病率和病斑直径，随着病害加重，果实病斑面积增大，至第3天，各处理组发病率达到100%。相比于对照组，1-MCP处理对贮藏在25 ℃的脆李果实褐腐病没有显著控制效果，这与凡先芳等[16]的研究结果相似。由图5-C2、5-C2、5-D2可知，4 ℃贮藏条件下，各处理组在脆李果实接种褐腐病第8天开始发病，比25 ℃条件下的果实发病晚，侵染速度慢。表明，褐腐病病原菌在25 ℃条件下对脆李果实的致病性强于4 ℃条件。与对照相比，损伤后经1-MCP处理再接种病原菌、1-MCP处理前/后损伤接种病原菌的脆李均能显著降低4 ℃贮藏期间果实褐腐病的发病率和病斑直径(P<0.05)。说明，1-MCP处理在4 ℃贮藏期内可抑制脆李果实褐腐病的发病程度。

下脚标1、2分别表示25和4 ℃；A、B分别表示接种褐腐病的脆李在25、4 ℃下的图片；相同贮藏时间不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.5 1-MCP处理对脆李果实硬度的影响

硬度是评价脆李品质的重要参数之一，硬度的变化影响脆李的品质特性。果实采后，在细胞壁降解酶等的作用下，细胞壁物质降解，导致果实硬度下降，而细胞壁作为阻止病原菌侵入的一道屏障，可在一定程度上抵抗病原菌的侵染[17-18]。

如图6所示，损伤接种病原菌的脆李在25和4 ℃贮藏期间果实硬度均呈下降趋势。损伤后经1-MCP处理再接种病原菌、1-MCP处理后损伤接种病原菌、1-MCP处理前损伤接种病原菌的脆李果实硬度的下降幅度显著低于对照组(P<0.05)，不同1-MCP处理组之间无显著性差异，4 ℃贮藏条件下的果实硬度始终高于25 ℃，说明低温条件贮藏对抑制脆李果实的软化有一定的辅助作用，但在抑制果实硬度下降过程中1-MCP发挥主要作用。

图6 25和4 ℃贮藏条件下1-MCP处理对采后脆李果实硬度的影响

3 讨 论

褐腐病是一种世界性分布的采后真菌病害，引起褐腐病的病原菌主要有核果链核盘菌(Monilinialaxa)、果生链核盘菌(M.fructigena)和美澳型核果链核盘菌(M.fructicola)[21]，其中美澳型核果链核盘菌的破坏力极强，是造成核果类果实采后病害的主要致病菌[6]。褐腐病可侵染花、叶及幼果，随果实的成熟度增加病害加重，具有潜伏性。采后在流通、储存条件有利于病害发生时，从果实损伤裂缝处侵入，在贮藏期间引起果实大量腐烂[22-23]。本试验通过对巫山脆李果实贮藏期褐腐病病原菌的分离，结合形态学鉴定、致病性测定、分子生物学鉴定，明确引起巫山脆李果实采后病害的主要致病菌为美澳型核果链核盘菌。该菌在离体条件下可以产生细胞壁降解酶，加速果实细胞壁的降解，破坏细胞壁的结构，为病原菌侵入创造有利条件[24]。

近年来研究表明，1-MCP作为一种乙烯拮抗剂，可延缓果实软化，提高水果的耐贮性[25-27]，并增强果实抗病性[28]，降低果实在贮藏期间的腐烂率。本试验中，低温贮藏期间，1-MCP处理前/后损伤接种病原菌的脆李发病率和病斑直径均明显小于对照组，这表明，1-MCP不仅可诱导果实产生抗病能力[29]，还可能对病原菌有直接抑菌作用，1-MCP可通过诱导孢子活性氧积累、破坏质膜的完整性，抑制孢子萌发和菌丝生长[12]。此外，损伤后经1-MCP处理再接种病原菌的脆李对褐腐病的控制效果最好，说明推迟果实伤口与病原菌的接触时间，有利于诱导果实伤口局部产生抗病性，提高果实的抗病能力[29]。大量研究表明，1-MCP对延缓果实硬度下降，维持细胞壁结构的完整性有积极作用[30-33]。本研究中发现1-MCP处理组在4 ℃条件下脆李果实硬度均维持较好，并且脆李褐腐病的发病率和病斑直径的扩展得到抑制，但在25 ℃条件下，1-MCP处理对果实硬度下降有抑制作用，对脆李褐腐病却没有显著控制作用。说明，1-MCP对脆李褐腐病的控制效果不仅仅与果实硬度有关，低温贮藏也是影响脆李果实褐腐病发生的因素之一。研究表明温度是影响病原菌致病力的因素之一[34]。低温贮藏可延长褐腐病病原菌孢子萌发的滞后期，减轻病原菌的致病能力，进而降低病原菌的侵染力[35]。虽然本研究明确了1-MCP在4 ℃条件下可抑制损伤接种脆李果实褐腐病的发病程度，但1-MCP是如何影响褐腐病病原菌的侵染过程及其作用机理，尚需进一步研究。

4 结 论

本试验从贮藏期自然发病的巫山脆李果实中分离鉴定出一株致病菌，经形态学鉴定、致病性测定、分子生物学鉴定等方法，明确为美澳型核果链核盘菌(M.fructicola)。接种实验表明，美澳型核果链核盘菌在25 ℃条件下的致病性比4 ℃条件下强。1-MCP对脆李褐腐病的影响结果表明，1-MCP处理可有效延缓脆李果实硬度下降，可显著降低4 ℃贮藏期间果实褐腐病的发病率和病斑直径(P<0.05)，对25 ℃条件下损伤接种脆李果实褐腐病的抑制作用，仅能维持在24 h内；因此，1-MCP结合4 ℃贮藏处理可有效抑制脆李褐腐病的发病程度。本研究明确了脆李采后褐腐病病原菌的种类、致病性情况及1-MCP对脆李褐腐病病原菌的影响，为脆李在贮藏保鲜过程中病害防治提供理论依据。