血清miRNA水平与急性缺血性脑卒中患者病情程度和炎症反应的相关性研究

张明颖 张小燕 肖井楠 王守章

近年来，随着人口老龄化的加剧和人们生活方式的改变，脑卒中发病率不断上升。脑卒中具有高致死率和高致残率，因此在脑卒中的早期对病情作出评估临床意义重大。急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）是脑卒中的重要类型，既往研究发现，免疫异常激活引发的炎症因子水平变化在AIS 发生、发展中发挥重要作用[1-3]。微小RNA（microRNA，miRNA）是非编码RNA，可通过与靶基因非编码区（3'UTR）结合调控靶基因表达，不仅参与细胞分化、凋亡等细胞周期活动，对机体氧化应激和炎症反应也有重要影响。研究发现，miR-122、miR-126、miR-221 可能与神经细胞缺血再灌注损伤相关，miR-30a、miR-409 可能与神经细胞自噬相关[4-7]。这些功能均与AIS 发生、发展相关，因此探讨此类miRNA 与AIS 的关系，可能对AIS 早期病情评估和治疗方案选择具有重要指示意义。基于此，本研究检测了AIS 患者血清miRNA 水平，分析其表达与AIS 病情程度和炎症反应的关系，以期为AIS患者的早期病情评估和临床治疗干预提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象及分组 选择2020年2月至2022年1月浙江新安国际医院收治的90 例AIS 患者作为观察组。纳入标准：（1）符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南对AIS 的定义[8]，并经头颅MRI 检查确诊为AIS。（2）临床资料完整。排除标准：（1）合并颅内感染、出血或颅内肿瘤等；（2）伴严重心、肝、肾重要脏器或血液系统疾病；（3）有精神疾病史或其他原因导致的神经功能缺损；（4）不耐受MRI 或有MRI 检查禁忌证。选取同期本院健康体检正常者110 名作为对照组。比较两组对象性别、年龄、BMI、高血压史、糖尿病史、卒中史、高脂血症、吸烟史和饮酒史等一般基线资料，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会审核批准，且所有纳入对象均知情同意。观察组按照梗死体积分为小梗死体积组（≤3 cm3，37 例）和大梗死体积组（＞3 cm3，53 例），按照美国国立卫生研究院卒中量表（national institute of health stroke scale，NIHSS）评分[9]分为轻度组（NIHSS 评分＜7 分，25 例）和中重度组（NIHSS 评分≥7 分，65 例）。

1.2 主要试剂 RNA 提取试剂盒购自天根生化科技北京有限公司，批号：20211112；人CRP ELISA 试剂盒、人TNF-α ELISA 试剂盒、人IL-12 ELISA 试剂盒和人IL-35 ELISA 试剂盒均购自上海科艾博生物科技有限公司，批号分别为20211011、20210108、202100922 和20210817。

1.3 方法 取受试者空腹静脉血约10 ml，离心吸取上层血清分装于A、B 两个试管。取A 管血清，根据试剂盒方法提取总RNA 并进行逆转录，采用实时荧光定量PCR 法检测miR-30、miR-122、miR-126、miR-221、miR-409 相对表达水平。引物由新贝（上海）生物科技有限公司提供，引物序列见表1。以U6 RNA为内参基因。根据2-ΔΔCt计算5 种miRNA 的相对表达水平。取B 试管血清，采用ELISA 法，分别测定血清中CRP、TNF-α、IL-12 和IL-35 表达水平。严格按照说明书操作执行。

表1 引物序列

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0 统计软件。正态分布的计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料用频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson 相关进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组对象血清miRNA、炎症因子水平比较 与对照组相比，观察组血清miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221 及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平显著升高，miR-409 水平显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 两组对象血清miRNA、炎症因子水平比较

2.2 不同梗死体积AIS 患者血清miRNA 和炎症因子水平比较 与小体积梗死组相比，大体积梗死组患者血 清miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221 及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平显著升高，miR-409 水平显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 不同梗死体积AIS 患者血清miRNA 和炎症因子水平比较

2.3 不同NIHSS 评分AIS 患者血清miRNA 和炎症因子水平比较 与轻度卒中组相比，中重度卒中组患者血 清miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221 及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平更高（均P＜0.05），miR-409水平更低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 不同NIHSS 评分AIS 患者血清miRNA 和炎症因子水平比较

2.4 AIS 患者血清miRNA 水平与梗死体积、NIHSS 评分及炎症因子水平的相关性分析 Pearson 相关分析表明，患者血清miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221水平与梗死体积、NIHSS 评分及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平均呈正相关（均P＜0.05）；而miR-409 与梗死体积、NIHSS 评分及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 均呈负相关（均P＜0.05），见表5。

表5 AIS 患者血清miRNA 水平与病情严重程度和炎症反应的相关性（r）

3 讨论

目前，临床诊断AIS主要是依靠CT、MRI等技术，准确性较高[10-12]。但AIS多发病突然，患者在出现明显症状前，鲜少主动进行相关检查。血清学指标检测具有采集方便、检测准确等特点，在诸多医学检测手段中应用广泛。如果能寻找到与AIS 发生、发展密切相关的血清学指标，将对AIS 的提前确诊和发展评估具有重要意义。

miRNA 是当前热门的血清学指标。已有研究发现miRNA 与AIS 发生、发展相关[13-16]。AIS 相关miRNA主要分为两类，一类与神经细胞凋亡、自噬以及脑细胞缺血、氧化和脑神经保护相关；另一类与神经缺血再灌注损伤相关。一项针对脑卒中小鼠的研究发现，与正常小鼠相比，脑卒中小鼠血清miR-30a 明显升高[17]。提示miR-30a 与神经细胞凋亡有关。罗斌等[18]在小鼠脑缺血再灌注损伤模型中发现，miR-122 可能通过抑制胰岛素样生长因子受体表达对脑部造成损伤。miR-126 被认为通过抑制血管黏附因子干扰血管内皮生长因子信号通路传导[19-23]。张伟等[24]发现，血清miR-221 对脑部损伤主要与脑部缺血再灌注损伤相关，其可能通过靶向激活炎症反应与急性脑梗死的发生及神经损伤的加重有关。本研究结果显示，miR-30a、miR-122、miR-126 和miR-221 水 平 在AIS 患者血清中明显升高；梗死体积更大的AIS 患者，病情也更严重。

miR-409 通过促进胰岛素样生长因子受体表达，起到保护脑部的作用。俞岭芳等[25]研究发现，AIS 患者外周血miR-409 水平下降，与本研究结果相似，提示血清miR-409 水平下降越明显的患者病情越严重。

炎症反应是AIS 患者机体的临床反应之一。本研究结果显示，AIS 患者CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平明显高于正常人群，随着梗死体积和NIHSS 评分升高，炎症因子水平越高，即提示患者病情越严重，炎症反应越剧烈。可能原因为AIS 是一种累及颈动脉、冠状动脉以及主动脉和桡动脉等全身性疾病，患者发病后，缺血中心区能量耗竭，附近区域神经细胞发生不可逆损伤。同时，缺血半暗带存在残余灌注，激活复杂的炎性级联反应，释放大量的炎症介质，最终破坏神经细胞，加重了机体的病变。

本研究相关性分析结果显示，AIS患者血清miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221水平与梗死体积、NIHSS评分及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平均呈正相关；miR-409 与梗死体积、NIHSS 评分及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平均呈负相关。提示miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221 和miR-409 可能通过影响机体的炎症水平，对AIS发生、发展产生影响。

由于本研究纳入样本数量有限，又是单中心研究，研究结果可能存在一定局限性。miRNA 是否能够作为AIS 患者新的生物标志物检测指标仍需要大规模多中心研究予以验证确定。同时，由于miRNA 调控AIS 发生和发展的机制尚不完全清楚，仍需通过大量基础试验进一步探索。

综上所述，miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221和miR-409 水平与AIS 患者病情严重程度和炎症反应相关。检测AIS 患者血清中miRNA 水平对预防AIS 发生、评估病情、延缓疾病进展具有一定的积极意义。