第二代生物乙醇制备研究进展

徐雪雯 李鹏辉 童国林

（南京林业大学，江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏南京，210037）

早在1900年代初期，生物乙醇就已在欧洲和美国广泛使用，并不是一种新能源，只是由于其生产成本比汽油高而被忽视。20世纪70年代，第一次世界石油危机爆发后，人们才开始关注生物乙醇的生产[1]。生物乙醇可以用作溶剂及化学工业中合成各种有机物的原料，如乙烯、聚乙烯、1,3-丁二烯和乙酸乙酯[2]。更重要的是，生物乙醇是一种可再生和可持续的液体燃料，具有的高氧含量特性使其燃烧更清洁，可降低有毒物质的排放量，并且生物乙醇是一种良好的内燃机燃料，可防止发动机爆震和过早点火，具有较高的抗爆值[3-6]。

生物乙醇可通过发酵从纤维素和半纤维素中提取的糖制得，根据制备原料不同，生物乙醇可分为以含糖类和含淀粉类的粮食作物为原料的第一代生物乙醇，木质纤维素类生物质以为原料的第二代生物乙醇和以水生藻类为主要原料的第三代和第四代生物乙醇。第一代生物乙醇生产技术成熟且具有较高的产率和产量[7]。第二代生物乙醇以木质纤维素类生物质为原料，其最大的优势在于原料来源广、产量大和不浪费人类食物资源，但木质纤维素乙醇被鉴定出29种杂质，含有高浓度的乙酸、乙醛、甲醇和呋喃相关化合物，而由糖或淀粉衍生物制备的第一代生物乙醇中只鉴定出16种杂质[8-11]。第三代、第四代生物乙醇以水生藻类为主要原料，如微藻和大型藻类，其中第四代生物乙醇使用的是具有高脂肪含量的转基因藻类。该原料含有脂质、蛋白质、碳水化合物/多糖，并具有薄的纤维素壁，有利于制备生物乙醇，但藻类预处理成本相较木质纤维素类生物质更加昂贵[12-13]。

本文综述了第二代生物乙醇制备过程中的原料优势，预处理和2种水解方式的优缺点，最后指出了当前第二代生物乙醇研究中的难点，为制浆造纸中黑液高值化利用提供一定参考。

1 原 料

生物乙醇的缺点包括能量密度较低、腐蚀性较强、火焰光度较低、蒸气压较低（使冷启动困难）、与水的混溶性较差等。生物乙醇生产的一个主要问题是生产原料的可用性[14]。

第一代生物乙醇以含糖类和含淀粉类2种粮食作物为原料。以糖为基础的可食用原料包括甘蔗、甜菜和甜高粱；淀粉基原料主要包括小麦、玉米、大麦、木薯、土豆、红薯及山药[7]。其中，糖基类可食用原料可直接发酵制备生物乙醇，而淀粉基原料需水解为淀粉再发酵制备生物乙醇[8]，具体制备过程如图1所示。

图1 第一代生物乙醇制备过程[8]Fig.1 Preparation process of first-generation bioethanol[8]

从原料的可用性来看，以木质纤维素为原料的第二代生物乙醇具有巨大的潜力，但其制备成本是化石燃料的2倍，制备过程包括预处理、水解、发酵以及蒸馏[15]，具体过程如图2所示。

图2 第二代生物乙醇制备过程[15]Fig.2 Preparation process of second-generation bioethanol[15]

第三代生物乙醇的制备原料是藻类，可分为微藻类和大型藻类。大型藻类因多糖和蛋白质含量高，主要用于人类消费。微藻非常适合用于生产生物乙醇，主要是因为它们的碳水化合物和脂质含量高，且在生物或非生物胁迫条件下会急剧生长。利用藻类中的碳水化合物和脂质为原料需要先进行预处理，预处理的基本目标是使原料易于提取或用于细胞内化合物（如蛋白质、碳水化合物、脂质、寡糖、色素等）的化学转化[12]。第三代生物乙醇的具体制备过程如图3所示。

图3 第三代生物乙醇制备过程[12]Fig.3 Preparation process of the third-generation bioethanol[12]

目前，最具发展潜力的主要是以木质纤维素类生物质为原料的第二代生物乙醇，为替代化石燃料的更清洁、低碳的生物燃料提供了机会。将第二代生物乙醇生产工艺与成熟的第一代生物乙醇生产设施相结合，利用协同效应，可以最大限度地集成工艺技术的优点、提高经济和环境效益[16]。木质纤维素原料包括针叶木、阔叶木、木树皮、锯末及枯树枝等。一些短周期木本品种，如杨树、柳树、云杉、松树、桉树和桦树是典型的能源植物，据报道，其纤维素含量在31%～45%（以绝干质量计）之间[17]，具有很高的可发酵糖回收潜力。其他木质纤维生物质原料组分如表1所示。

表1 各种原料组分[18-20]Table 1 Components of various raw materials[18-20] %

2 预处理

以木质纤维素类生物质为原料制备生物乙醇的主要挑战在于原料预处理。在生产第二代生物乙醇之前，对木质纤维素类生物质进行预处理至关重要。高效的预处理应适用于各种基材，使用廉价且易于回收的试剂，具有低能耗、低投资和维护成本等特点。

预处理过程会破坏与半纤维素结合的纤维素和木质素，降低纤维素的结晶度，增加最适合酶促攻击的无定形纤维素的比例。纤维素是由D-吡喃式葡萄糖重复单元经过β-1,4-D-糖苷键连接成的线性高分子聚合物，是细胞壁的主要骨架，具有生物相容性和亲水性等特性。纤维素分子链为线性结构，结构规整，无大侧链，同时分子链上富含易形成氢键的羟基，因此纤维素分子易结晶。纤维素不易受酸或高温处理的影响，但可以用酶水解[21]。半纤维素是植物细胞壁中与纤维素紧密结合的一类杂多糖的总称，也是自然界中含量仅次于纤维素的第二大类多糖。半纤维素对高温和酸处理高度敏感，主要是因为其具有无定形、不稳定结构，链长较短，支化度较高，易化学水解[22]。半纤维素在高达190 ℃的温度下自水解，转化为可溶性低聚木糖；在90～130 ℃的温度下进行稀硫酸处理，几乎可以完全水解得到戊糖。

和其他木质纤维素生物质一样，使用纤维素酶和半纤维素酶直接水解，易受到木质纤维素的复杂结构和结晶度的限制。因此，为了将半纤维素和纤维素完全转化为单糖，需要物理、化学及酶水解预处理[23]。预处理作用在于破坏纤维素结晶区和木质素3D结构，最大程度减少糖损失，提高酶转化率，降低对酶或微生物的抑制[24]。

木质纤维素类生物质可以通过切片、研磨、剪切或碾磨进行粉碎，减小颗粒尺寸并增加比表面积，有利于纤维素酶作用于生物质表面并增加纤维素的转化率。通过机械研磨、粉碎等物理方法可以显著降低粒径和结晶度，有利于后续水解发酵，但机械研磨所需的能耗与研磨后原料粒径紧密相关，需要相对高的能量输入来实现高的酶水解速率和可发酵糖产量。其他有用的物理处理方法包括热解、γ射线辐照、微波、红外线或超声处理[25-26]。Thangavelu等人[25]对木质纤维素类生物质进行低微波功率预处理后，还原糖浓度相比未经微波预处理的常规水解高30%，利用酿酒酵母将可发酵糖转化为生物乙醇，产率达40.4%。低微波功率预处理不仅有利于生物乙醇的制备，在能耗消耗方面也具有一定的优势。Liu等人[26]在比较γ射线辐照预处理与其他预处理方法对以微晶纤维素为原料制备生物乙醇的影响时，为了检验γ射线辐照的有效性，在实验中采用891 kGy的辐照剂量，对通过同步糖化发酵制备的生物乙醇进行处理。结果表明，相比于酸预处理，γ辐照预处理具有更高的生物乙醇转化效率。虽然微波、γ辐射等辅助预处理方式在制备生物乙醇方面更有效，但是其安装成本高，不利于工业化应用。

在典型的联合预处理过程中，第1步一般采用合适的酸、碱及蒸气爆破预处理方式，脱去生物质中半纤维素部分；第2步采用稀酸、稀碱及有机溶剂预处理，有效去除生物质中木质素部分[27]。物理化学方法比单纯的物理方法更有效[28]。稀酸和浓酸都被证实能够对高度复杂的木质纤维素原料进行预处理，但浓酸预处理有毒，且具有腐蚀性，需要昂贵的耐腐蚀设备。稀酸预处理因低成本、高活性和易获取等优点，被广泛使用。Wang等人[29]采用质量分数2.2%的稀硫酸处理玉米芯，达到了97%的总葡萄糖回收率和75%的木糖回收率，实现了高效的糖转化。王慧等人[30]对玉米秸秆分别采用热水和碱2种方式预处理，碱预处理后玉米秸秆的细小纤维含量增加，并且随细小纤维含量增加，纤维素酶解效率提高。O3、H2O2试剂处理木质纤维素类生物质，其机理与制浆过程中氧脱木质素机理类似，O3、H2O2、ClO2等在氧化脱木质素过程中释放的大量自由基可以降低原料中木质素的含量，但是与酸、碱等预处理相比，成本有所增加[31]。有机溶剂预处理是从木质纤维素材料中分离纤维素和木质素的一种十分具有吸引力的方法，主要采用的有机溶剂包括乙醇、甲醇、乙酸、甲酸、丙酮、甘油或苯酚，其中低沸点的醇类有机溶剂，因其沸点与水的沸点相差较大而易回收，获得了更为广泛的关注；高沸点的有机溶剂虽然在葡萄糖回收率等方面具有优势，但其高度挥发性及易燃性使操作风险性和工业应用成本升高[28]。

用于生物质糖化前的预处理包括氨纤维爆破（AFEX）、自水解（蒸汽爆破）、SO2蒸汽爆破、酸处理和碱处理[32]。在蒸汽爆破中，生物质被高压饱和蒸汽快速加热一段时间后又迅速释放压力，导致蒸汽在木质纤维素基质内膨胀，从而破坏细胞壁结构的单个纤维。添加SO2催化剂可以减少原料预处理时间，降低处理温度，更有效地去除半纤维素，有利于生物乙醇的转化。AFEX是一种碱性热预处理，是适用于农业残余物的预处理方式，缺点是对含有较高木质素含量的生物质处理效率低[33]。Rochón等人[34]以桉树木屑为原料，采用无碱蒸汽爆破预处理，当反应温度200 ℃、处理时间10 min时，从半纤维素水解产物中可获得83%的木糖和17%的低聚木糖，实现了无碱蒸气爆破预处理下高效的糖转化。

生物预处理在以木质纤维生物质原料作为基质供真菌生长的同时，通过真菌分泌的生物酶定向降解木质纤维中的木质素。尽管生物预处理相比于物理法能耗低，相比于化学法不需要化学品且反应条件温和，但是需要很长的处理时间才能达到较高的酶解率[35]。

3 水解及发酵

纤维素水解也称糖化，是将纤维素转化为葡萄糖的过程。水解主要有2类：酸水解和酶水解。酸水解的工艺技术成熟但对设备腐蚀强，回收和废水处理困难，对环境不友好，糖转化率低[36]。酶水解选择性好，反应条件温和，对环境设备友好，但是在酶活性、重复利用率及成本方面有很大的发展空间。酶水解的效率不仅取决于预处理条件和生物质中木质素的存在，还取决于纤维素原纤维包裹在木质素鞘中的方式。虽然葡萄糖和乙醇的产量随着纤维素含量的增加而增加，但它不是影响葡萄糖和乙醇产量的唯一因素，当生物质的木质素含量在7%～9%时，葡萄糖和乙醇的产率会显著降低，导致乙醇产率降低[37]。酶解的作用过程主要包括纤维素酶吸附在纤维素表面、纤维素水解及纤维素酶解吸[38-39]。影响水解的主要因素是底物抑制剂木质素及生物质孔隙率，碱预处理比其他预处理能更显著增加生物质孔隙率[40]。高结晶度会阻碍纤维素的酶促分解，使分子链更有序，纤维内部的孔减少。因此，半纤维素和木质素的去除有利于提高基底酶的可及性，主要是因为孔径和基底比表面积的增加。

酶水解是从木质纤维素底物生产乙醇的成本效益的关键，因其过程温和，具有潜在的高产率，并且与酸或碱水解相比，维护成本较低[41]。该过程与许多预处理方法兼容，但在酶水解之前进行化学预处理时，需要去除对酶有毒的物质。影响酶促糖化过程的因素包括底物浓度、酶负荷、温度和糖化时间[42]。纤维素酶常用于第二代生物乙醇制备过程中的木质纤维素残基水解，然而纤维素酶对预处理后的木质纤维素的活性依旧很低。为攻克这一难题，研究人员探索了纤维单胞菌属、芽孢杆菌属和微球菌属在不同的pH值（5～9）和温度（20～50 ℃）下对椰壳纤维的内切葡聚糖酶活性。结果表明，纤维单胞菌在pH值中性和40 ℃条件下表现出最高活性[43]。此外，纤维素酶占据生物乙醇制备成本的绝大部分。为了降低制备成本，Baskaran等人[44]以里氏木酶菌NCIM 1186作用于石榴皮制备纤维素酶，在最佳培养基和工艺条件下，纤维素酶的最大产量为12.3 IU/mL，实现了以废制纤维素酶，降低了生产成本。纤维素酶与木质素的非生产性结合，可能会在高底物负载下增加，特别是随着水解的进行和纤维素量的减少。Rosgaard等人[45]采用了“分批补料”方式，酶解预处理后的大麦秸秆，逐渐加载底物或底物加酶以将底物水平从5%提高到15%，实现高底物浓度的水解，得到高浓度葡萄糖。

在发酵方面，工业上主要使用的是酿酒酵母和运动发酵单细胞菌[46]。根据菌株的不同，发酵酵母发育的最佳温度通常在25～35 ℃。酵母发酵对象一般为六碳糖，但是经过培养和筛选得到的酿酒酵母IPE005可以同时发酵葡萄糖和木糖。例如树干毕赤酵母可天然发酵木糖产生乙醇，主要的缺点是生产过程中会产生乙酸、糠醛等副产物。五碳糖糖化发酵制备生物乙醇是限制木质纤维素原料使用的主要因素之一。Aybüke等人[47]首次报道了以含有大量五碳糖的苹果渣为原料制备生物乙醇的研究方法，优化了一些关键参数，如生物质负载、补充剂（氮和矿物质源）和酶水解对生物乙醇生产的影响，乙醇理论产率为84.1%。在10%苹果渣负载下，树干毕赤酵母可生产14.36 g/L的生物乙醇。高效的葡萄糖/木糖共发酵能够完全利用木质纤维素生物质中的所有可用糖，从而提高木质纤维素生物质精炼厂的总转化率。Wu等人[48]将酿酒酵母与树干葡萄球菌共培养，从富含戊糖和己糖的木质纤维素水解物中高效制备生物乙醇，具有95.97%的高糖转化率及0.39 g/g的乙醇产量。Bisht等人[49]研究了一种突变酵母Pichia kudriavzevii BGY1-γm，与天然菌株相比，其在葡萄糖/木糖共发酵过程中具有高ADH活性，能够高效地生产乙醇。

为提高生物乙醇生产的效率，研究人员已经提出了不同的整合水解和发酵的方法，包括单独水解和发酵（SHF）、同步糖化发酵（SSF）及同步糖化共发酵（SSCF）[50-52]。SHF有2个阶段，水解和发酵过程分开进行，即预处理的木质纤维素生物质首先通过酶降解成葡萄糖和木糖，然后发酵成乙醇。其优势在于酶水解和发酵都在各自的最佳条件下发挥作用，而抑制酶活性的糖的积累仍然是最终影响乙醇产量的主要因素[53]。SSF将生物质的糖化与在单个反应器中同时发酵释放的糖相结合。该过程的关键特征是糖从生物质中形成后，会迅速转化为乙醇，从而减少培养基中抑制性糖的积累。与SHF工艺相比，其操作方便、设备要求低，培养基不易受到污染，效率更高[54]。该工艺的主要缺点是难以同时考虑酶和微生物来优化工艺参数。SSCF可以将木质纤维素预处理和水解过程中释放的所有己糖和戊糖（主要是葡萄糖和木糖）共同发酵。SSCF的酶水解与发酵同时发生，与单独的水解和共发酵（SHF）相比，投资成本低，且能实现更高的乙醇生产率[55-56]。

近年来，有许多关于第二代生物乙醇制备的研究，由于原料的选取不同，后续的预处理及水解发酵参数都不尽相同。White等人[57]以麦芽汁提取后剩余的残渣酒糟（SG）为原料，开发了稀酸和酶处理以将半纤维素和纤维素部分转化为葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，具体流程如图4所示。在用纤维素酶和半纤维素酶制剂进行酶消化之前，溶解谷物最优工艺是用0.16 mol/L HNO3在121 ℃下预处理干燥的碾磨谷物15 min。对20%的SG制备水解物，用0.16 mol/L HNO3预处理，部分中和至pH值=5～6，并用酶消化18 h，得到还原糖浓度为66.6 g/L（27.4 g/L葡萄糖、16.7 g/L木糖和11.9 g/L阿拉伯糖）。用毕赤酵母和马氏克鲁维酵母发酵该水解物48 h，分别得到8.3和5.9 g/L乙醇。然而与合成培养基中的葡萄糖/木糖混合物相比，底物利用效率较低，表明水解产物中存在来自SG的酵母抑制化合物。Phuong等人[7]以稻草为原料，采用Na2S辅助碱法蒸煮，利用响应面法确定了制浆的最佳工艺参数为活性碱用量7%、温度100 ℃、时间120 min，获得了51.8%的最大糖产率。表明采用Na2S辅助的碱法蒸煮预处理可使糖化效率达91.2%，以最大限度地酶解实现可持续生物乙醇的生产。具体工艺流程如图5所示。

图4 以麦芽酒SG为原料制备生物乙醇流程[57]Fig.4 Preparation process of bioethanol with malt liquor SG as raw material[57]

图5 以稻草为原料制备生物乙醇流程[7]Fig.5 Preparation process of bioethanol from rice straw[7]

Ren等人[8]开发了一种受控的亚硫酸氢镁预处理（MBSP），实现生物乙醇生产、木糖-寡糖（XOS）和木质素磺酸镁（ML）制备同时进行，在预处理程度（PS）为3.66，170 ℃下处理40 min后，从1 kg小麦秸秆中获得了约136 g生物乙醇、98 g XOS和133 g ML，葡聚糖含量约70.8%，酶解率超过90%。受控的MBSP是小麦秸秆生物精炼的潜在经济盈利预处理工艺。Qiu等人[9]对小麦秸秆进行磷酸加过氧化氢（PHP）预处理，在高负荷下通过同步糖化发酵进行乙醇转化。结果表明，经过PHP预处理的小麦秸秆的固载率可大幅提升至20%，增加酵母添加量可促进乙醇转化，但反应并不明显，利用响应面法优化同步糖化发酵条件后，在固体负载为15.3%的情况下，同步糖化发酵处理120 h后，乙醇转化率为88.2%，100 g小麦秸秆可收获15.5 g乙醇。具体过程如图6所示。

图6 PHP预处理小麦秸秆制备生物乙醇流程[9]Fig.6 Preparation process of bioethanol from wheat straw with PHP pretreatment[9]

Ajayo等人[10]以纸桑木为原料，在温度34.7 ℃，71.3% H3PO4和4.84% H2O2条件下优化处理3.3 h，脱木质素效率达97%，半纤维素去除率达100%，获得了493 mg/g原木的高葡萄糖产量。Prajapati等人[11]利用甘蔗渣（SCB）为原料，用由管状曲霉NKBP-55产生的纤维素酶和半纤维素酶混合物进行酶处理。SCB水解产物通过葡萄糖和木糖发酵酵母Candida shehataeNCIM 3501发酵成乙醇，得到最大乙醇浓度为15.54 g/L，发酵效率为77.9%。结果表明，A.tubingensis酶混合物可使SCB有效水解并转化成生物乙醇。

得到可使用的生物乙醇前还需经纯化处理，常采用的方法有化学脱水、真空蒸馏、共沸蒸馏、萃取蒸馏、膜分离、分子筛吸附及扩散蒸馏等[58-59]。

4 结语与展望

第一代生物乙醇制备工艺已十分成熟，基于此，第二代生物乙醇的制备还需加强预处理方面的研究，以及就如何利用半纤维素五碳糖仍需进一步培育新型酵母，或组合酵母对五碳糖、六碳糖共同发酵。虽然第三代生物乙醇的制备已有不少研究，并且具有不占用耕地和吸收空气中CO2，减少对环境污染的优势，但藻类预处理成本昂贵，对此还需时间去进一步挖掘与改良。目前来说，第二代生物乙醇的预处理方法及发酵过程中酵母的培育与选择仍是当前的研究热点。

制浆造纸过程中产生的黑液中含有部分纤维素和半纤维素，若能够对其进行糖化发酵制备生物乙醇，无疑是开拓了黑液高值化利用的一个全新领域。此前关于黑液中纤维素与半纤维素制备生物乙醇的研究仅限于亚硫酸盐法制浆黑液，因其他方法产生的黑液至今未能有合适的酵母菌去处理，今后若能在该难点取得突破，制浆造纸行业便能实现质的飞跃。