基于镜检和高通量测序技术的铜锈环棱螺胃含物分析

张灿灿，张丹丹，王志强，罗福广，文衍红，蒋 明，李艳和

(1.华中农业大学水产学院/水产养殖国家级实验教学示范中心，武汉 430070；2.广西柳州市渔业技术推广站，广西柳州 545006；3.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223)

铜锈环棱螺(Bellamyaaeruginosa)是我国主要的土著淡水螺类群体之一，属于软体动物门腹足纲前鳃亚纲中腹足目田螺科环棱螺属[1]。据研究，新鲜螺肉营养价值高，含有人体所必需的7种氨基酸、多种矿物元素及维生素等[2]，具有天然保健功能，使其在多种行业及水生态保护修复中都具有重要作用与突出价值[1]。铜锈环棱螺的市场需求量逐年增大，但其人工养殖技术的发展却较为滞后，目前主要依靠人工捕捞，供应量远小于其市场需求量。因此，深入开展铜锈环棱螺的人工养殖、营养需求、饵料投喂和繁育特性等研究显得尤为重要。而动物的食性研究是营养生态位研究的重要组成部分[3]，可以为动物的食物选择性、物质代谢、繁育特性以及人工养殖等研究提供有价值的参考资料和基础数据[4]。

高通量测序具有较高灵敏性和准确性，能检出降解和频次较低的DNA序列，通过比对捕获的DNA，可将物种精确分类到种级别分类单元，基于DNA序列数，还可判断动物对食物取食的相对量和偏好[5]。显微镜镜检分析一直是动物食性研究中的传统方法[6,7]，是一种检验动物短期内摄食的直接手段，该方法使用显微镜观察并分析肠胃内含物中未被消化的食物种类和数量，可以反映动物在近期内的摄食情况。然而，大量的研究表明每一种食性研究方法在实际应用中均存在局限性。将镜检分析这种传统的食性研究方法与高通量测序这种新兴方法相结合，可以突破单种方法的局限性，提高对生物食性研究的可靠性[8]。

目前有关螺类的食性已有较多研究，屈铭志等[9]通过模拟水库现场，直接观察铜锈环棱螺的摄食行为。段晓姣[10]、刘学勤[11]基于镜检分析法，分别对梨形环棱螺(Bellamyapurificata)、长角涵螺(Alocinmalongicornis)、大沼螺(Parafossaruluseximius)和纹沼螺(Parafossarulusstriatulus)的肠道内含物进行鉴定，分析了其食性。而将高通量测序技术和镜检鉴定结合起来，分析铜锈环棱螺胃和后肠内容物组成的研究较少。本研究选取真核生物18S可变区V4区、细菌16S V3V4(a)和真菌ITS1(a)作为标记基因，结合高通量测序技术和镜检鉴别结果，对铜锈环棱螺的食性进行研究，以期为开展环棱螺人工养殖、营养需求、饵料投喂和繁育特性研究提供重要的基础数据和资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2021年4月2日，在广西柳州里高镇螺蛳养殖基地某铜锈环棱螺高产水田随机采集铜锈环棱螺样本若干(60个以上)。采样后将螺样放入清水中进行冲洗，去除表面的底泥，用吸水纸吸干表面水分，测量其体高、体重及壳宽。

1.2 显微镜镜检

将每个螺的胃和后肠移入盛有10～20 μL生理盐水的培养皿中充分洗涤后制成镜检样品。利用显微镜镜检法鉴别全部镜检样品。藻类及浮游动物参照文献[12-15]鉴定到属。

1.3 高通量测序

随机选取30个铜锈环棱螺用无菌镊子将胃分离，每10个一组，参照文献[16]中的SDS法对环棱螺胃含物的基因组DNA进行提取。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法检测DNA质量与浓度。DNA检测合格后，分别选用针对真核生物18S可变区V4区、细菌16S V3V4(a)和真菌ITS1(a)区设计的三对特异性引物(表1)对其进行PCR扩增。PCR产物经纯化、浓度检测合格后，使用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit进行文库构建，构建好的文库经过定量和检测，利用NovaSeq 6000 SP Reagent Kit(500 cycles)进行2×250 bp的双端测序。测序工作在上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

1.4 数据处理与分析

1.4.1 摄食强度分析

参照文献[17]的判断方法，对铜锈环棱螺肠道充塞度进行分级(0～5级)。

1.4.2 食物组成分析

分别计算铜锈环棱螺的摄食率(FR)、食物出现率(F)、数量百分比(N)、重量百分比(W)和相对重要性指数百分比(IRI)，评估铜锈环棱螺胃和后肠的食物组成情况，计算方法如下：

FR=(含有食物的肠道数量÷解剖的总肠道数量)×100%

F=(包含某食物的肠道数量÷解剖的总肠道数量)×100%

N=(某食物成分的数量÷全部食物的数量)×100%

W=(某食物成分的重量÷全部食物的重量)×100%

相对重要性指数=F×(个数百分比N%+重量百分比W%)

IRI=(相对重要性指数÷相对重要性指数总和)×100%

1.4.3 测序数据分析

首先对测序原始数据进行质控、去噪、拼接、去嵌合体。对每个OTU的代表序列，在QIIME2软件中使用默认参数，使用Naive Bayes分类器进行物种分类注释。比对Greengenes数据库[18]，统计每个样本的胃含物在界、门、纲、目、科、属、种分类水平的组成。

2 结果

2.1 铜锈环棱螺的摄食强度

共分析30只铜锈环棱螺，体高分布范围为13.48～22.41 mm，体质量分布范围为0.44～2.27 g，结果表明取样随机，大小均有，可以反映养殖阶段铜锈环棱螺胃含物组成的共性。其中，26个肠道含食物，4个肠道完全无食物，摄食率为86.87%。由图1可看出，铜锈环棱螺的充塞度主要集中在1级，即食物占肠管的1/4，其次主要是2级，食物占肠管的1/2，而充塞度为5级的最少为0。

图1 铜锈环棱螺肠道充塞度情况

2.2 镜检分析铜锈环棱螺胃和后肠中食物组成情况

总共有30个样本用于食物组成分析，壳宽在8.89～15.09 mm之间。由表2可以看出，从铜锈环棱螺胃中检出藻类8门33属，解剖发现铜锈环棱螺的胃肠道里主要食物是浮游植物，如裸藻、颤藻、扁裸藻、黄丝藻等(图2)，还有较多的泥沙和有机碎屑，以及少量的水生植物碎屑。

图2 显微镜视野下的铜锈环棱螺胃内部分食物种类

从出现率来看，胃中小球藻最高为63.33%，其次黄丝藻为46.67%；后肠隐藻最高为43.33%，其次小球藻和黄丝藻均为33.33%，颤藻为30%，席藻、栅藻、双菱藻、羽纹藻、实球藻、卵囊藻、小环藻、黄管藻和三毛金藻最低为3.33%。从数量百分比来看，胃中小球藻最高为34.42%，席藻、蹄形藻最低为0.05%；后肠颤藻最高为21.85%，席藻、栅藻、双菱藻和羽纹藻最低为0.18%。除去泥沙，从重量百分比来看，胃中裸藻门为46.16%，绿藻门为35.70%，蓝藻门为6.68%，硅藻门为6.19%，隐藻门为5.27%，其中裸藻最高为46.16%，其次为衣藻22.74%；后肠蓝藻门为39.96%，隐藻门为18.19%，绿藻门为16.76%，裸藻门为15.59%，硅藻门为9.49%，其中颤藻最高为39.96%，其次隐藻为18.19%。从相对重要指数百分比来看，胃中小球藻最高为37.66%，其次衣藻为23.09%；后肠中颤藻最高为35.74%，其次隐藻为25.58%(表2)。

表2 铜锈环棱螺的食物组成

续表2

续表2

从表3可看出，镜检结果显示铜锈环棱螺的胃含物中小球藻的F、N和IRI最高，裸藻的W最高，而后肠内容物中颤藻的N、W和IRI居首，隐藻的F较其他藻类更大，表明铜锈环棱螺胃内主要的食物成分是小球藻和裸藻，后肠中则以隐藻和颤藻为主。

表3 铜锈环棱螺胃和后肠的食物百分比

2.3 高通量分析铜锈环棱螺胃内食物组成情况

2.3.1 细菌成分分析

采用Illumina测序平台对3组样品的16S rRNA基因V3-V4区进行测序，共得到有效序列249 343条，鉴定出23门37纲55目85科88属39种。高通量测序分析表明铜锈环棱螺的胃内细菌菌群主要由变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)等23门(图3)和盐单胞菌属(Halomonas)、乳球菌属(Lactococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)及节杆菌属(Arthrobacter)、链霉菌属(Streptomyces)等88属组成(图4)。

图3 基于门水平的铜锈环棱螺胃中细菌菌群结构

图4 基于属水平的铜锈环棱螺胃中细菌菌群结构

2.3.2 真核生物成分分析

通过对Reads进行剪切过滤，平均每个样品测得143 663条Reads，通过质控，平均得到135 756条有效数据，质控有效率达94.50%。以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，共得到51个OTUs，然后与Silva132、NCBI数据库进行物种注释，经过筛选之后一共获得16门29纲32目36科38属。

测序结果表明：本次共检测到了包括软体动物门(Mollusca)、领鞭毛虫门(Choanoflagellata)、脊索动物门(Chordata)、担子菌门(Basidiomycota)、节肢动物门(Arthropoda)、纤毛门(Ciliophora)、绿藻门(Chlorophyta)、金藻纲(Chrysophyceae)、甲藻纲(Dinophyceae)、Streptophyta、真眼点藻纲(Eustigmatophyceae)、Discosea、丝足虫类(Cercozoa)、隐藻纲(Cryptophyceae)、腹毛纲(Gastrotricha)等在内的16门(图5)。在属水平上共检测到了棕鞭藻属(Ochromonas)、微芒藻(Micractinium)、小球藻属(Chlorella)、Dolicholatirus、Phymorhynchus、Polyoeca、斑纹海豚属(Lagenorhynchus)、跗线螨属AD1063(Tarsonemidaegen.sp.AD1063)、内生真菌属(Gloeotinia)、Jaminaea、微拟球藻属(Nannochloropsis)等在内的38属(图6)。

图5 铜锈环棱螺胃含物基于门分类水平的真核生物分布

图6 铜锈环棱螺胃含物基于属分类水平的真核生物分布

2.3.3 真菌成分分析

在对铜锈环棱螺胃内真菌菌群组成分析中，主要选择最具有代表性的门和属两个相对丰度水平对真菌菌群组成进行分析。从真菌门水平分析，三十个环棱螺胃含物中可注释到门水平的有子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、被孢霉(Mortierellomycota)、毛霉门(Mucoromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)共5个门，其中子囊菌门和担子菌门为主要优势菌门(图7)。

图7 铜锈环棱螺胃含物基于门分类水平的真菌结构

样品在属水平上共注释到50个属，平均丰度占比均低于1%，分别是马拉色氏霉菌属(Malassezia)、曲霉菌属(Aspergillus)、被孢霉属(Mortierella)、红菇属(Russula)、炭团菌属(Hypoxylon)、蜡壳菌属(Sebacina)、嗜热真菌属(Thermomyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、拟棘壳孢属(Pyrenochaetopsis)、镶刀菌属(Fusarium)、毕赤酵母属(Pichia)、支顶孢属(Acremonium)、Solicoccozyma等(图8)。

图8 铜锈环棱螺胃含物基于属分类水平的真菌结构

3 讨论

本研究运用高通量测序技术和镜检方法对螺蛳养殖高产水田里的铜锈环棱螺胃含物进行了分析，经鉴定，胃含物中包含细菌18门88属，真核生物16门38属，真菌5门50属。至于养殖铜锈环棱螺与非养殖铜锈环棱螺的食性是否存在不同则需要进一步的研究。从本次的采样情况来看，30个铜锈环棱螺中有4个肠道不含食物，摄食率为86.87%，空肠率为13.13%。在本次采样解剖时发现部分铜锈环棱螺体内含有仔螺，一方面猜测采样时处于环棱螺的繁殖期，在繁殖季节环棱螺会减少摄食，导致空肠率偏高。另一方面可能是采样时间为春天，而有研究表明梨形环棱螺因摄食强度不同，在春季空肠率较大[10]。因此，在铜锈环棱螺繁殖季节，根据其胃含物分析结果表明，在养殖中此阶段需注意不宜过多投喂饲料造成不必要的浪费，而以肥水和培养藻类为主则较好。

高等动物都会与丰富多样的微生物群落有联系，绝大部分的微生物又主要存在于胃肠道内[19]。本次测序发现，铜锈环棱螺胃含物中变形菌门的含量远远大于其他菌门，为铜锈环棱螺胃肠道中的绝对优势菌，其次主要是放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门。这与齿纹蜒螺[19]、玫瑰高原鳅[20]等的肠道菌群组成类似，只是比例不同。变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门普遍存在于动物胃肠道[21]，其中变形菌门是细菌中最大的一门，对宿主的营养代谢十分重要[22]。拟杆菌门和厚壁菌门都可以促进宿主的营养物质吸收，拟杆菌门主要参与宿主免疫系统的发育，而厚壁菌门可以产生多种消化酶帮助宿主分解各种物质[23,24]。在属水平上优势菌群主要有乳球菌属、肉杆菌属、曲霉菌属、被孢霉属及毕赤酵母属等。其中乳球菌和肉杆菌是水产养殖中常用的益生菌，可提高机体的免疫力，抑制消化道有害菌生长[25]。曲霉属和被孢霉属菌株可产专一性催化水解壳聚糖的壳聚糖酶，也有助于宿主清除体内垃圾、预防疾病[26]。毕赤酵母属则能生产植酸酶，对改善动物的生产性能和减少环境污染具有十分重要的意义[27]。

本研究发现铜锈环棱螺的胃含物以浮游植物和碎屑为主，其中藻类是最主要的食物，有机碎屑次之，原生动物含量较低，这与段晓姣[10]对生态沟渠中梨形环棱螺的食性研究相似，而与刘学勤[11]对湖泊底栖动物食物组成的研究有一定的差异，其调查结果为环棱螺的主要食物是有机碎屑，造成这种现象的原因推测一方面是采样位置的不同；另一方面是研究方法的差异，刘学勤采用的是传统的镜检技术，而光学显微镜很难对粒径较小的浮游植物分类鉴定[28]。

在本研究中，利用高通量测序方法对30个铜锈环棱螺样品的胃含物分别进行16S、18S、ITS测序，鉴定出细菌18门88属、真核生物16门38属、真菌5门50属；采用显微镜镜检技术对30个铜锈环棱螺的胃含物和后肠内容物进行鉴定，在胃中观察到藻类8门33属和原生动物如无节幼体、表壳虫、砂壳虫，在后肠中则发现藻类7门25属，其中铜锈环棱螺胃内主要的食物成分是小球藻、裸藻和衣藻，后肠中则主要是隐藻和颤藻，推测铜锈环棱螺可能更喜食小球藻、裸藻和衣藻，而对隐藻和颤藻表现出较低选择性。结果显示高通量测序和显微镜镜检食性研究两种方法都鉴定出的食物成分只有绿藻门的小球藻属，充分证明了铜锈环棱螺对小球藻的选择性。

本研究和其他研究都可以表明高通量测序可以检出主要的食物成分以及肉眼无法鉴定的成分[29,30]。镜检分析法可直接检验动物短期内摄食情况，但其在很大程度上取决于观察者的鉴定方法和食物的消化程度。高通量测序技术虽能克服这些问题，却无法根据检测到的食物成分DNA分析出食物的体积和重量，只能进行多样性分析。关于这一点本研究结合高通量测序和显微镜镜检法，从铜锈环棱螺胃内菌群到胃和后肠内含物组成进行分析，了解了其食物组成和摄食强度[31]，极大增强了描述环棱螺食性的能力，可为开展环棱螺人工养殖、营养需求、饵料投喂和繁育特性提供重要的基础数据和资料。

致谢

感谢华中农业大学石瑞雪、肖作铭和田子楷在实验器材的使用以及实验技术方面的指导！