金鲳鱼皮胶原蛋白肽改善光老化皮肤的作用研究

◎余 博

（安徽农业大学，安徽 安庆 230036）

金鲳鱼，一种海洋经济鱼类，是近年来我国华南地区具有代表性的海水养殖品种之一。金鲳鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，据廖伟等研究，采用酶解法提取的金鲳鱼皮胶原蛋白主要属于Ⅰ型胶原[1]；对比大鲵、鲤鱼源的胶原蛋白，金鲳鱼皮胶原蛋白具有更高的变性温度，同时还含有大量与抗氧化性有关的疏水性氨基酸。我们推测这些差异可能使金鲳鱼皮胶原蛋白具有更特殊的生物学活性。基于此，本文以金鲳鱼皮为原料，制备胶原蛋白抗氧化肽，评价其体外抗氧化活性对光老化皮肤组织抗氧化能力及胶原蛋白合成的影响。

1 试验方法

1.1 鱼皮胶原蛋白肽的制备

用自来水清洗鱼皮后，将其剪成小块，碱液浸泡24 h 以去除油脂，蒸馏水冲洗至pH=9.5，使用脂肪酶及碱性蛋白酶处理5 h，沉淀物浸泡2 h，而后用0.01 M 柠檬酸浸泡至肿胀，90 ℃水浴提取3 h，过滤后浓缩，喷雾干燥即得胶原蛋白。配置20 mg/mL 胶原蛋白溶液，50 ℃下用0.5%胶原蛋白酶酶解5 h，灭酶后使用碱性蛋白酶与胰蛋白酶质量比为1:4 的复合酶酶解5 h，灭酶后浓缩冻干，得到鱼皮胶原蛋白肽粉末，密封保存。

1.2 金鲳鱼皮胶原蛋白肽分子量的测定

以金鲳鱼皮胶原蛋白肽以及上述标准品为原料，流动相分别配制5 mg/mL、1 mg/mL 的溶液，经微孔过滤后进样。在0.5 mL/min 流速，214 nm 下进行，取20 L 样品溶液进行分析。取得出的数据对数值，使用计算机进行采集分析，与时间作标准曲线后计算得出金鲳鱼皮胶原蛋白肽样品的分子量[2]。

1.3 氨基酸组成分析

准确称取金鲳鱼皮胶原蛋白肽30 mg，加入体积为10 mL、浓度为6 M 的盐酸溶液（溶液中含有0.5%巯基乙醇），而后使用氮气进行封管处理，在110 ℃条件下水解22 h，用超纯水将水解液稀释到体积为10 mL，并从水解液中取出1 mL 并在60 ℃下旋转蒸干，再加入5～6 滴超纯水洗涤、蒸干，重复3 次。然后加入0.02 M 盐酸定容至5 mL，0.22 μm水膜层进行过滤后的滤液放入液体瓶中，用氨基酸自动分析仪对上述过程处理后的滤液进行测定。

1.4 DPPH 自由基清除率测定

分别将2 mL 金鲳鱼皮胶原蛋白肽、罗非鱼胶原蛋白肽、三文鱼胶原蛋白肽以及2 mL 的0.15 mmol/LDPPH（以95%乙醇溶解）混合均匀。在黑暗中反应30 min在517 nm 下测混合液吸光值，同时测定以等体积95%乙醇与样液混合的吸光值，以及等体积95%乙醇与DPPH 混合液的吸光值。按式（1）计算金鲳鱼皮胶原蛋白肽对DPPH 自由基的清除率：

1.5 ABTS 自由基清除率测定

ABTS 与过硫酸钾混合在室温、黑暗下反应12～16 h。PBS 稀释混合液至734 nm 检测波长下吸光值为0.70±0.02。3.9 mL 稀释液与0.1 mL 肽溶液混合反应6 min 后，测量734 nm 处的吸光值。同条件下，PBS 代替肽溶液进行反应，测出吸光值。按公式计算金鲳鱼皮胶原蛋白肽、罗非鱼胶原蛋白肽、三文鱼胶原蛋白肽溶液的ABTS 自由基清除率：

式中：为空白样品在734 nm 检测波长处的吸光值；是试样在该检测波长下的吸光度[3]。

1.6 还原力测定

将2.5 mL 肽溶液、2.5 mL pH=6.6 的磷酸盐缓冲液、2.5 mL 1% 铁氰化钾溶液混合，并在50 ℃水浴20 min，冷却后，加2.5 mL 10% 三氯乙酸，3 000 r/min 速度下离心10 min，取5 mL 上清液加入等体积超纯水及1 mL 0.1%三氯化铁溶液，测定其700 nm 处的吸光度值。肽溶液的还原力以吸光值表示。

1.7 动物实验

以紫外线照射诱导建立光老化小鼠模型。用6%硫化钠乙醇溶液对小鼠背部皮肤脱毛[4]。脱毛小鼠分为正常对照组（N）、模型组（M）和金鲳鱼皮胶原蛋白肽高低剂量组（Tb-SCPH，Tb-SCPL），每组10 只小鼠。N、M 组都给予小鼠相同体积的生理盐水；受试物高低剂量组分别灌胃300、600 mg/kg·d 的金鲳鱼皮胶原蛋白肽，灌胃体积为1 mL/100 g·bw。光老化小鼠采用UVA 隔日照射的方式，前两周，辐射剂量为最小红斑剂量（MED），然后每周增加1 MED，4 MED 后保持不变，并采用紫外强度监测仪记录辐射量。末次灌胃0.5 h 后处死小鼠，取背部相同部位皮肤保存于-80 ℃备用[5]。

1.8 皮肤中羟脯氨酸的测定

取皮肤组织约40 mg，130 ℃下封管水解4 h，移取0.5 mL 水解溶液，按照夏光华等的方法吸光值[6]，最后根据确定好的Hyd 标准曲线得出线性方程，并计算小鼠皮肤组织中Hyd 的浓度。

1.9 皮肤中抗氧化相关指标测定

取皮肤组织适量，按照皮肤组织与生理盐水1:9的比例进行混合，使用离心机在7 000 r/min，4 ℃离心20 min，最后按试剂盒说明书测上清液中相关指标。

1.10 统计学分析

用SPSS 17.0 软件对数据进行单因素方差分析，LSD 法对结果进行两两比较，P＜0.05，差异有显著性，实验结果用±s 表示。

2 结果与分析

2.1 Tb-SCP 对DPPH 自由基清除率的影响

自由基清除剂能提供电子与DPPH 单电子配对，使混合液在检测波长处对光的吸收减少。图1 为金鲳鱼、三文鱼、罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液对DPPH自由基清除率的影响。由图1 可知，随着肽溶液浓度增加，DPPH 自由基清除能力增强，且Tb-SCP 作用最显著。在浓度为15 mg/mL 时，Tb-SCP 对DPPH 自由基的清除率达45.11%。

图1 金鲳鱼、三文鱼、罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液对DPPH 自由基清除率的影响图

2.2 Tb-SCP 对ABTS 自由基清除率的影响

ABTS 在氧化剂的作用下会成为蓝绿色的ABTS 自由基，自由基清除剂作用下该过程受到抑制。检测波长下吸光值的大小可间接反映肽溶液的抗氧化能力。图2 表明随着金鲳鱼、三文鱼、罗非鱼的鱼皮胶原蛋白肽浓度的增加，对ABTS 自由基的清除能力也变强。与前者相比，Tb-SCP 作用最为显著，浓度15 mg/mL 时，清除率达93.97%。

图2 金鲳鱼、三文鱼、罗非鱼的鱼皮胶原蛋白肽溶液对ABTS 自由基清除率的影响图

2.3 Tb-SCP 对还原力的影响

溶液抗氧化能力可通过测定其还原能力来反映。通过测定肽溶液还原力可知，金鲳鱼、三文鱼、罗非鱼的鱼皮胶原蛋白肽溶液的还原力，都随着浓度的增加而变大，三者中以Tb-SCP 的还原力最强，在溶液浓度为15 mg/mL 时，其吸光值达到了0.42。

2.4 Tb-SCP 对皮肤组织MDA 含量的影响

ROS 在体内引起的过氧化使脂质反应为MDA，研究者往往通过测定组织内MDA 含量反映组织受氧化造成损伤的程度，实验中对照组MDA 含量较正常组增加了53.60%，说明紫外线照射造成了皮肤的氧化损伤，Tb-SCP 显著地降低了小鼠皮肤中MDA 的含量，特别是高剂量组MDA 含量降低了28.70%，这些结果都表明Tb-SCP 能有效地抑制光老化皮肤中MDA 的含量，降低了小鼠体内自由基的氧化反应，减少了组织损伤。

2.5 Tb-SCP 提高皮肤组织羟脯氨酸含量

Hyp 是皮肤胶原蛋白合成的必需氨基酸，皮肤中羟脯氨酸含量变化可间接反映胶原蛋白的合成及含量情况，进而反映皮肤衰老及恢复情况。实验表明：模型组皮肤羟脯氨酸含量远低于正常组小鼠皮肤，这说明紫外线照射引起胶原蛋白降解，羟脯氨酸流失，皮肤衰老；而Tb-SCP 明显提高了皮肤中羟脯氨酸含量，这也表明其有助于促进小鼠的胶原蛋白合成和延缓皮肤光老化引起的皮肤衰老。

3 讨论

不同的抗氧化方法可以从不同的方面反映抗氧化剂的抗氧化能力，并阐述相关的抗氧化机制，本文主要选取测定了肽溶液对DPPH 自由基、ABTS 自由基的清除率和还原力，从自由基清除和还原能力两方面的抗氧化机制评价Tb-SCP 的抗氧化活性。结果表明：Tb-SCP 具有很强的自由基清除能力和还原能力。将从金鲳鱼皮中提取的胶原蛋白肽与市场上常见的淡水鱼种罗非鱼及深海鱼种三文鱼进行对比，发现金鲳鱼皮胶原蛋白肽在自由基清除及还原方面能力均强于另两个，充分证明了金鲳鱼胶原蛋白肽具有良好的抗氧化性。

Hyp 是皮肤的成纤维细胞在合成胶原时所必需的氨基酸。与光老化组对比，Tb-SCP 组Hyp 含量显著增高，这说明TbSCP 干预后，组织中胶原蛋白合成增高，降解降低。Tb-SCP 作用下，体内抗氧化体系的平衡得到恢复，我们推测自由基所阻断的TGF-β/smad 信号通路在Tb-SCP 的干预下得到了缓解，该通路中的重要因子TGF-β1 可以促进成纤维细胞增殖。同时，该通路的恢复将指导体内胶原蛋白合成增多，从而改善了皮肤光老化带来的皮肤衰老问题。

4 结语

通过酶解法制备的Tb-SCP 分子量集中分布在500 Da，且具有良好的抗氧化能力。在体外可以有效清除自由基，在体内具有良好的促进体内抗氧化体系平衡的作用。能提高光老化小鼠皮肤组织中GSH-Px、CAT 和SOD 的活力，降低MDA 含量，提高Hyp 含量，促进胶原蛋白合成和抑制胶原蛋白降解，从而延缓光老化引起的皮肤衰老，是一种可供开发利用的抗光老化材料。