红花黄色素联合二甲双胍对早期糖尿病肾病患者肾脏纤维化、尿足细胞损伤的影响

鲍喜静 李建英 彭一 董陆玲 张贵山 杨秀红 王新婷 辛丽娟 张翠静 吴嘉鸣

糖尿病肾病(diabetic nephrology，DN)主要病理变化是肾小球硬化、肾小管-间质纤维化，患者表现为肾功能降低及蛋白尿，严重者逐渐发展至肾功能衰竭，预后较差[1-3]。因此，在DN早期采取积极干预手段逆转或延缓疾病进展是改善预后的关键。本研究探讨了红花黄色素联合二甲双胍对早期DN患者肾脏纤维化、尿足细胞损伤的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2015年10月至2016年10月80例DN患者的临床资料，随机分为对照组和观察组，每组40例。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组一般资料比较 n=40

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①符合2型糖尿病、早期DN诊断标准；②患病时间至少1年；③患者均知情同意。

1.2.2 排除标准：①重要脏器功能障碍；②其他原因(高血压、尿路结石等)引起的尿蛋白排泄率增加；③恶性肿瘤患者；④对研究药物过敏者。

1.3 治疗方法 2组均给予常规治疗，包括健康宣教、饮食指导、运动锻炼等。

1.3.1 对照组：给予盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370)，2 g/d，口服。

1.3.2 观察组：给予盐酸二甲双胍片的同时静脉滴注红花黄色素(浙江永宁药业股份有限公司，批号 220050146)，100 mg红花黄色素+250 ml 0.9%氯化钠溶液，1次/d。连续治疗14 d。

1.4 检测方法

1.4.1 标本采集：采集患者空腹肘静脉血5 ml，离心，取上清，存于-20℃冰箱。另留取治疗前后患者中段尿20 ml，500 r/min离心10 min，弃上清。

1.4.2 肾脏纤维化指标：采用放射免疫法测定血清层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。严格按照试剂盒说明书操作。

1.4.3 转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad：采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。严格按照试剂盒说明书操作。

1.4.4 足细胞损伤标志物：采用ELISA测定尿液中Podocin、Nephrin、ZO-1水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。严格按照试剂盒说明书操作。

1.4.5 足细胞影响因子：采用ELISA测定尿液中结缔组织生长因子(CTGF)、骨桥蛋白(OPN)、骨形态发生蛋白(BMP-7)水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。严格按照试剂盒说明书操作。

1.4.6 足细胞数：在荧光显微镜下观察尿沉渣中呈绿色荧光的圆形或椭圆形细胞，选取不同部位20个视野，计数足细胞数，取均值。

2 结果

2.1 2组肾脏纤维化指标比较 2组治疗前LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平明显低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)，且观察组治疗后LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平均显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 2组肾脏纤维化指标比较

2.2 2组TGF-β1、Smad水平比较 2组治疗前TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平明显低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)，且观察组治疗后TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 2组TGF-β1、Smad水平比较

2.3 2组足细胞损伤标志物比较 2组治疗前Podocin、Nephrin、ZO-1水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后Podocin、Nephrin、ZO-1水平明显低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)，且观察组治疗后Podocin、Nephrin、ZO-1水平低于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 2组足细胞损伤标志物比较

2.4 2组足细胞影响因子比较 2组治疗前CTGF、OPN、BMP-7水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后CTGF、OPN、BMP-7水平明显低于治疗前，BMP-7水平明显高于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)，且观察组治疗后CTGF、OPN、BMP-7水平低于对照组，BMP-7水平高于对照组(P<0.05)。见表5。

表5 2组足细胞影响因子比较

2.5 2组足细胞数比较 2组治疗前足细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后足细胞数明显低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)，且观察组治疗后足细胞数低于对照组(P<0.05)。见表6。

表6 2组足细胞数比较 n=40,个

3 讨论

糖尿病患者机体长期处于糖脂代谢异常状态，该状态可引起全身各器官损害，其中DN是最常见的糖尿病微血管并发症，容易导致肾小球硬化、基底膜增厚及系膜细胞基质积聚，这是造成肾功能减退及尿蛋白量增加的重要病理机制[4,5]。LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C是评估肾脏纤维化的常用指标，DN患者血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平通常表现为异常增高，检测其水平能够在一定程度上反映肾脏纤维化进程及疾病治疗效果。本研究结果显示，2组治疗前LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平明显低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)，且观察组治疗后LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平低于对照组(P<0.05)，表明红花黄色素联合二甲双胍能够抑制肾脏纤维化进程，从而改善肾功能。

研究证实，TGF-β1/Smad信号通路在DN发生发展中发挥关键作用[6,7]。TGF-β1具有调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学功能，此外TGF-β1在促进慢性肾脏纤维化和系膜细胞基质积聚中发挥重要作用。TGF-β1与TGF-βⅠ型受体结合形成受体复合物，通过磷酸化效应激活其受体底物Smad蛋白，后者转移至细胞核中可调控相关转录因子的表达，促进Ⅰ型胶原分泌及肾小管上皮-间质转化(EMT)进程，最终导致肾脏纤维化形成[8,9]。

大量研究表明，DN患者和肾脏损伤模型动物血清中TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白表达上调，而采用基因敲除、抑制剂或miRNA抑制TGF-β1/Smad信号通路活化能够改善肾脏纤维化[10,11]。本研究结果表明，2组治疗前TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平明显低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)，且观察组治疗后TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平低于对照组(P<0.05)，提示红花黄色素联合二甲双胍可能通过调控TGF-β1/Smad信号通路发挥肾脏保护作用。

此外，TGF-β1/Smad信号通路参与诱发肾脏局部氧化应激反应和氧自由基大量生成，从而引起尿足细胞结构蛋白的表达和分布发生改变，导致其与肾小球基底膜间黏附性降低，进而脱落随尿液排出。因此，DN患者尿足细胞损伤是肾脏滤过膜通透性增加及蛋白尿产生的本质原因之一[12,13]。在此过程中大量足细胞标志分子随之进入尿液，其中Podocin、Nephrin、ZO-1是反映尿足细胞氧化应激损伤程度的指标，共同参与裂孔膜复合体的形成，从而维持肾小球基底膜完整性[14,15]。此外，CTGF具有促进成纤维细胞增殖、细胞外基质积聚等作用，在肾小球硬化、肾小管纤维化形成中发挥重要作用；OPN通过调控免疫炎性反应促进尿足细胞脱落；BMP-7能够抑制炎性反应，从而减轻尿足细胞脱落[16,17]。

本研究结果显示，2组治疗前Podocin、Nephrin、ZO-1、CTGF、OPN、BMP-7水平及足细胞数比较，差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后Podocin、Nephrin、ZO-1、CTGF、OPN水平及足细胞数明显低于治疗前，BMP-7水平明显高于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)，且观察组治疗后Podocin、Nephrin、ZO-1、CTGF、OPN、BMP-7水平及足细胞数低于对照组，BMP-7水平高于对照组(P<0.05)，表明红花黄色素联合二甲双胍能够减轻肾脏足细胞损害，从而改善DN患者病情。

综上所述，红花黄色素联合二甲双胍可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通路改善早期DN患者肾纤维化，并减轻尿足细胞损伤，效果优于单纯二甲双胍治疗。TGF-β1/Smad信号通路可能成为治疗早期DN的潜在靶点。