基于“髓系骨病”理论探索Osterix阳性骨髓间充质干细胞维持骨稳态的作用

王玉杭，王煦程，王迪，杨婧，曾庆贺，袁文华，童培建，金红婷

(1.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学第三临床医学院，浙江 杭州 310053；3.浙江中医药大学医学技术学院，浙江 杭州 310053；4.浙江省中医院，浙江 杭州 310006)

成骨细胞特异性转录因子Osterix是骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞所必需的转录因子[1]。Osterix阳性细胞主要靶标于干骺端和骨干处[2]。髓为奇恒之腑，是维持人体生命活动的基本物质[3]。受科技水平的限制，古人未能探明髓的本质。“浙派中医”骨伤团队开创了“髓系骨病”理论[4]，总结性地提出了“诸骨病萎，皆属于髓”的理念。现代医学研究表明，骨髓间充质干细胞是软骨细胞和成骨细胞共同的前体细胞，骨髓间充质干细胞的功能与髓的功能高度相似，骨髓间充质干细胞及其微环境可滋养骨骼，维持骨稳态，发挥“髓以养骨”的功效[5-6]。因此，越来越多的学者认为骨髓间充质干细胞可能是髓的物质基础之一[7-8]。我们基于“髓系骨病”理论，探索了Osterix阳性骨髓间充质干细胞维持骨稳态的作用，现总结报告如下。

1 材料与仪器

1.1 实验动物Osterix-CreERT2小鼠(Osterix基因靶标小鼠)和Rosa26-DTA小鼠(白喉毒素A片段报告小鼠)购自Jackson Laboratory，Rosa26-tdTomato小鼠(番茄红荧光报告小鼠)为馈赠所得。Osterix-CreERT2小鼠与Rosa26-tdTomato小鼠交配获得子代Osterix-CreERT2/Rosa26-tdTomato小鼠，Osterix-CreERT2小鼠与Rosa26-DTA小鼠交配获得子代Rosa26-DTA小鼠和Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠。实验动物合格证号：SYXK(浙)2021-0012。实验方案经浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会审查通过。

1.2 实验试剂4%多聚甲醛、14%乙二胺四乙酸二钠(disodium ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)、他莫昔芬、阿尔新蓝8GX、碘酸钠、硫酸钠、硫酸铝铵、二氨基联苯胺、苏木精(美国Sigma公司)，胃蛋白酶抗原修复液(北京中杉金桥生物科技有限公司)，鼠源碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)抗体(Arigo生物科技公司)，鼠源脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein，FABP4)抗体、鼠源荧光CD73抗体、山羊抗小鼠IgG荧光二抗(英国Abcam公司)。

1.3 实验仪器VIP 5Jr组织脱水机(日本樱花公司)，AP280-2组织包埋机、HM355S石蜡切片机(德国Microm公司)，显微镜和显微拍摄系统(德国蔡司公司)，SkyScan1176 Micro-CT(比利时Bruker公司)。

2 方 法

2.1 动物分组及干预选取3只子代Osterix-CreERT2/Rosa26-tdTomato小鼠纳入示踪组，6只子代Rosa26-DTA小鼠纳入空白组，6只子代Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠纳入Osterix阳性细胞剔除组。各组小鼠均于1月龄时按0.1 mg·g-1体质量腹腔注射他莫昔芬，每天1次，连续注射5 d，以诱导白喉毒素表达，特异性剔除Osterix阳性细胞。

2.2 实验指标观察

2.2.1Osterix阳性细胞在小鼠股骨中的分布情况观察 他莫昔芬干预结束后2周，脱颈处死示踪组小鼠，切取左侧股骨，置于4%多聚甲醛中固定3 d，14%EDTA脱钙14 d，流水冲洗24 h后常规冰冻切片，厚度3 μm。切片用胃蛋白酶抗原修复液在37 ℃处理15 min，加入鼠源荧光CD73抗体(用PBS按1∶1000稀释)在4 ℃孵育过夜，山羊抗小鼠IgG荧光二抗(用PBS按1∶200稀释)中孵育20 min，DAPI染色。在光学显微镜下观察Osterix阳性细胞分布情况。

2.2.2小鼠股骨骨微结构观察 他莫昔芬干预结束后6个月，脱颈处死Osterix阳性细胞剔除组和空白组小鼠，切取左侧股骨。将股骨标本用保鲜膜包好，置于Micro-CT载物台上，以股骨远端生长板为中心选择感兴趣区，对其中的松质骨和皮质骨进行处理，经过测量规划和收集后，利用NRECON1.6.10软件将2D投影图转化为3D容积图，经CTAn1.10软件分析后利用CTVOX3.0.0软件构建3D图像，观察小鼠股骨骨微结构，并测量骨松质和骨皮质的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量及骨小梁分离度。

2.2.3小鼠股骨组织形态观察 Micro-CT检查结束后，将Osterix阳性细胞剔除组和空白组小鼠股骨标本置于4%多聚甲醛中固定3 d，14%EDTA脱钙14 d，流水冲洗24 h后常规石蜡包埋切片，厚度3 μm。从Osterix阳性细胞剔除组和空白组各随机选取3只小鼠的股骨切片，进行阿尔新蓝-苏木精染色后，在光学显微镜下观察股骨组织形态，并用Image-Pro Plus软件测定脂滴面积，测定结果以脂滴积分光密度与总光密度的比值表示。

2.2.4小鼠股骨中ALP和FABP4表达量测定 从Osterix阳性细胞剔除组和空白组随机选取3只小鼠的股骨切片，在胃蛋白酶抗原修复液中于37 ℃孵育30 min，加入一抗(鼠源ALP抗体，用PBS按1∶200稀释；鼠源FABP4抗体，用PBS按1∶500稀释)，在4 ℃孵育过夜，加入山羊抗鼠二抗(用PBS按1∶1000稀释)孵育20 min，二氨基联苯胺染色，苏木精复染。用Image-Pro Plus软件测定ALP和FABP4表达量，测定结果以阳性染色物积分光密度与总光密度的比值表示。

2.3 数据统计采用SPSS25.0软件进行数据统计分析，空白组和Osterix阳性细胞剔除组骨松质骨密度、骨松质骨小梁厚度、骨松质骨小梁分离度、骨松质骨体积分数、骨松质骨小梁数量、骨皮质骨密度、骨皮质骨体积分数、骨皮质骨小梁厚度、骨皮质骨小梁分离度、骨皮质骨小梁数量、脂滴面积、ALP表达量、FABP4表达量的组间比较均采用t检验，检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1 Osterix阳性细胞在小鼠股骨中的分布情况Osterix阳性细胞中tdTomato蛋白的红色荧光与DAPI染色的细胞核蓝色荧光分布高度重合，均位于髓腔[图1(1)至图1(3)]；Osterix阳性细胞中tdTomato蛋白的红色荧光与CD73染色的骨髓间充质干细胞细胞核绿色荧光分布高度重合，均位于髓腔[图1(4)至图1(6)]。

图1 小鼠股骨组织荧光染色结果(×5)注:(1)(4)中红色荧光部分为Osterix阳性细胞中的tdTomato蛋白；(2)中蓝色荧光部分为DAPI染色的细胞核；(3)为tdTomato蛋白的红色荧光与DAPI染色的细胞核蓝色荧光重合显示结果；(5)中绿色荧光为CD73染色的骨髓间充质干细胞细胞核；(6)为tdTomato蛋白的红色荧光与CD73染色的骨髓间充质干细胞细胞核绿色荧光重合显示结果。

3.2 小鼠股骨骨微结构观察结果实验过程中Osterix阳性细胞剔除组1只小鼠死亡；此外，空白组和Osterix阳性细胞剔除组各有1只小鼠的数据明显异于其他小鼠，数据统计时予以剔除。Osterix阳性细胞剔除组的骨松质骨密度和骨松质骨小梁厚度均低于空白组，骨松质骨小梁分离度高于空白组；2组的骨松质骨体积分数、骨松质骨小梁数量比较，组间差异均无统计学意义(图2、表1)。Osterix阳性细胞剔除组的骨皮质骨密度、骨皮质骨体积分数、骨皮质骨小梁厚度均低于空白组；2组的骨皮质骨小梁分离度、骨皮质骨小梁数量比较，组间差异均无统计学意义(图2、表2)。

表1 小鼠股骨骨松质骨微结构参数

表2 小鼠股骨骨皮质骨微结构参数

图2 小鼠股骨Micro-CT图像

3.3 小鼠股骨组织形态观察结果与空白组相比，Osterix阳性细胞剔除组小鼠股骨生长板软骨-骨连接处有大量脂滴生成，脂肪空泡堆积(图3)。Osterix阳性细胞剔除组的脂滴面积大于空白组[(203.514±0.957)%，(241.061±5.805)%，t=-6.381，P=0.003]。

图3 小鼠股骨组织阿尔新蓝-苏木精染色结果(×10)

3.4 小鼠股骨中ALP和FABP4表达量测定结果免疫组织化学染色结果显示，Osterix阳性细胞剔除组可见少量ALP和大量FABP4，而空白组ALP较多、FABP4较少(图4、图5)。Osterix阳性细胞剔除组股骨ALP表达量低于空白组，FABP4表达量高于空白组(表3)。

表3 小鼠股骨中碱性磷酸酶和脂肪酸结合蛋白4表达量

图4 小鼠股骨组织中碱性磷酸酶免疫组织化学染色结果(×20)

图5 小鼠股骨组织中脂肪酸结合蛋白4免疫组织化学染色结果(×20)

4 讨 论

中医学理论认为，肾藏精，精生髓，髓居骨中以养骨，骨骼赖之以生长。《说文解字》言：“髓者，骨中脂也。”这都表明髓是骨骼生长、发育和代谢过程中的重要物质基础。骨骼得到髓的濡养，则生长发育正常，保持其坚刚之性；骨骼失去髓的濡养，就会出现骨骼脆弱、发育不良等疾病[9]。《素问》中“骨者，髓之府”“髓者，骨之充也”的论述表明，髓是藏于骨内的精微物质，在维持骨稳态方面发挥着重要作用。而《素问》中“肾者，水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿”的论述则表明，骨痿的病机是肾虚而髓不能满。因此，“髓萎骨枯”是骨病的一个重要病机。中医学理论中的髓与现代医学中骨髓间充质干细胞在功能上具有高度相似性。有研究发现，骨髓间充质干细胞拥有分化为成骨细胞的潜力[10]和参与造血的功能，骨髓间充质干细胞及其微环境还可滋养骨骼，发挥“髓以养骨”的功效，这都与髓的藏精气、充骨化血的功能类似。因此越来越多的研究者认为，骨髓间充质干细胞可能是髓的物质基础之一。

骨髓间充质干细胞存在于成体骨髓中，在一定条件诱导下可分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞。Osterix是骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞所必需的转录因子。Ono等[2]的研究证实，出生3 d的小鼠骨表面大部分成骨细胞和软骨膜中的细胞都呈现出Osterix-CreER标记；在随后1年中，这些Osterix阳性细胞分化为骨干骺端和骨干处的成骨细胞。Zhun等[11]的研究显示，Osterix缺失小鼠可表现出成骨细胞分化和新骨形成停滞的现象。综上所述，骨髓间充质干细胞维持着骨的内环境稳态[12]，这种内环境稳态一旦被打破就会发生类似“髓萎骨枯”的髓系病证。

结合现代医学的干细胞理论[13-14]和中医学理论[4,9,15]，我们认为骨髓间充质干细胞很可能是髓的物质基础之一。在本研究中，注射他莫昔芬可诱导白喉毒素表达，使Osterix阳性细胞剔除组子代Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠的Osterix阳性细胞被特异性剔除。免疫荧光染色结果提示，Osterix阳性细胞为骨髓间充质干细胞，高效靶标于小鼠股骨髓腔内。Micro-CT和阿尔新蓝-苏木精染色结果显示，Osterix阳性细胞剔除后小鼠股骨出现骨量减少、骨微结构受损、脂滴形成增多、骨皮质厚度降低等骨质疏松的特征性表现；免疫组织化学染色结果显示，Osterix阳性细胞剔除组股骨ALP表达量减少、FABP4表达量增多，提示特异性剔除Osterix阳性细胞可使小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力减弱、向脂肪细胞分化的能力增强。骨质疏松症属中医学“骨枯”“骨痿”范畴。《素问·痿论》曰：“肾气热则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”这说明Osterix阳性细胞剔除小鼠的表现与“髓减”十分相近。此外，陈光华等[16]的研究证实，骨髓间充质干细胞移植可提高骨质疏松大鼠的骨代谢水平。邹振等[17]的研究显示，基于中医“肾主骨生髓”理论的肾髓同治方可在一定程度上防治小鼠骨质疏松症，其机制主要与调控骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路有关。这些都表明，骨髓间充质干细胞与髓有着相近的特性。

本研究的结果提示，Osterix阳性骨髓间充质干细胞发挥着维持骨稳态的作用。