八宝景天总黄酮的提取纯化及抗氧化抑菌活性的研究进展

郑乐乐，钱义慧，马丽君，张双双，李 娜

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000）

八宝景天（Hylotelephium erythrostictum），别名蝎子草、长药景天、华丽景天，是一种可以为药用的、名为八宝的草药。又名“八宝”“胡豆七”“活血三七”等，属于景天科八宝属的草本植物，其叶子肥大，根茎粗壮，根茎、叶子及花朵都可以入药，并且一年四季都可以随时采摘，但更多的人喜欢用新鲜的八宝景天来入药。八宝景天在《海药本草》 《开宝本草》 《本草纲目》等中医学典籍中均有记载，在东北、河北、湖北、江苏、浙江、安徽、河南、四川、贵州、云南、山西等地都有大量栽种，而且生长状况良好，是一种极易栽培、生长范围很广的植物。八宝景天无论在生物学上还是在化学上，其性质均很稳定、口感较为苦涩，并带有略微的酸味。此外，八宝景天还有清热解毒、祛风除湿、促进皮肤血液循环、止痛止血的作用。经过对八宝景天深入研究，发现其及其提取物中含有非常复杂、丰富且多元化的生物功能性物质，其中包括各种天然活性生物碱、甾体、鞣质、黄酮类化合物及其衍生物、缩合单宁和生氰化合物等，使得黄酮类化合物在医疗应用方面的成效非常显著。

黄酮类化合物（Flavonoids 或flavonoes compounds） 是指基本母核为2- 苯基色原酮的类化合物，具有一个由中间的吡喃或吡喃酮环（C） 连接的2 个苯环（A 和B） 的三环核心，是一大类的次生代谢产物，在长期的自然选择过程中所形成，在植物群落中有大量的存在。目前，已经研究发现了近万种植物中含有类黄酮类成分，并且类黄酮的种类已经超过了5 000 种，其中最为常见的是：二氢黄酮及二氢黄酮醇类、异黄酮和黄酮醇类、黄烷醇类、花色素类、双黄酮类、查耳酮类及其他黄酮类。虽然大多数的类黄酮都可以与糖基化合成糖苷，但是也有一些是以游离状态存在。黄酮类化合物的药理作用多种多样，已被大量的试验研究证实，其药理作用有抗氧化、消炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗癌、抗衰老、抗抑郁、抗心脑血管疾病、抗糖尿病及其并发症、调血脂及提高免疫力等。

八宝景天作为一种观赏性植物，在园林绿化中得到了广泛的应用，然而关于八宝景天更高的药用价值，特别是其黄酮类物质的有效提取、分离、纯化及其抗氧化、抑菌作用的深入研究寥寥无几。现综述八宝景天总黄酮的提取工艺、总黄酮经大孔树脂纯化的最优分离条件，以及八宝景天总黄酮的抗氧化、抑菌作用的生物活性。

1 总黄酮的提取

1.1 超声提取法

超声波萃取是一种有效成分的提取方法，在中药活性成分的提取中被广泛应用。超声提取技术是将高能超声注入到提取体系中，使体系内形成无数个小孔并快速闭合，当小孔闭合时，将会产生瞬间高压，推动超声提取加快提取速度。通过介质吸收超声波并产生内摩擦，使其产生强烈的振动，通过这个过程，使超声振动的机械能转化为介质内能。同时，介质的温度和植物天然产物组织的内部温度也会逐步升高，导致2 种压力均可引起试样表面的变形和破坏。此外，溶剂和样品粒子之间存在不同的加速度，二者之间产生的摩擦会导致2 个碳原子之间的碳碳双键发生断裂，导致聚合物的裂解。超声提取对象物质的方法主要有3 种机理，即热空化学作用、热作用和机械作用，这3 种机理被广泛应用于超声提取技术中。将超声波萃取技术应用于植物活性成分的提取过程中，不仅能节省能源，还能有效地提高提取效果。

1.2 酶解法

一些特定的酶类可以在一定程度上促进某些特定的化学反应，使其具有较高的反应效率和较高的产物活性。酶解法是将蛋白质的肽键或胺键进行特定的水解，蛋白质经酶解后，其极性基团数目增加，肽链长度变短，肽链相对分子质量下降，使蛋白质的溶解性增强，功能形状也会随之变化，细胞壁或者蛋白质与多糖的结合物被破坏，目标产物——总黄酮类化合物被释放。由于植物细胞壁主要由一种可溶于水的纤维素构成，且含有少量的果胶，因此在大量的试验中，人们常采用木质素（Lignose） 抑制剂或多聚果胶酶（Polypectinase） 抑制剂，将细胞壁组分直接氧化降解，以获得细胞膜包裹的胞浆系统物质。破壁后，对提取活性物质和有机溶剂的萃取具有极大的促进作用。

1.3 酶法辅助超声提取

通常用于试验研究的萃取法，其具有简便、快速和安全等特点，然而任何方法都具有两面性，该方法存在提取时间长，提取效率低等问题。针对这一问题，拟以八宝景天为对象，利用适宜的酶和适宜的超声能量，在有机溶剂中高效提取其有效成分。利用响应曲面（Box-behnken） 法建立酶辅助超声波的优化模型，确定酶辅助超声波的最优条件，实现快速、温和的提取。在Box-behnken 模型中，能够更清楚地看到每个因素对反应值的影响，为八宝景天中总黄酮的深层次开发利用提供参考。

吕凯波等人[1]在前期的研究中，发现酶辅助超声波法的最佳条件为超声功率100 W，料液比1∶17（g∶mL），超声处理时间32 min，纤维素酶添加量约为2.6%，超声酶解持续时间49 min，试验证明，该方法提取的总黄酮含量可达14.01%，该方法提取的活性成分具有（89.9±0.06） %的抗·OH 能力，研究发现，与水煎法、回流法、酶法、超声波法等相比较，酶辅助超声波法在提取液中的活性成分含量要高出10%以上，超声波与酶法结合提取的活性物质表现出了较好的抗氧化性，该活性物质的DPPH·、·OH 清除率都可提高20%以上。唐文文等人[2]利用超声波乳化结合双酶（纤维素酶、果胶酶） 快速高效地提取了当归表层部位中的总黄酮，最佳的提取工艺为酒精体积分数小于50%，料液比大于50∶1，超声波提取时间大于41 min，双酶量地浓度比（纤维素酶∶果胶酶= 2∶1） ＞0.68 g/L，酶的完全水解所需地超声波时间大约是93 min，在以上5 个最基本的水解条件下，从当归地表部位中提取的总黄酮的提取率达到了8.18%。孟永海等人[3]利用单因素试验，对乙醇萃取主要药物所使用酶的含量百分数及主要药物用量、乙醇体积分数、溶液pH 值、料液分配体积比、萃取温度及时间、超声温度、时间及功率等进行了研究，并对萃取方法的影响进行了探讨；以上述结果为依据，应用响应面法对酶法辅助超声法提取刺玫果实中总黄酮的工艺进行了优化，最终得到了总黄铜的最佳提取方案为纤维素酶用量15 mg/g，乙醇体积分数60%，溶液pH 值5，药物∶乙醇= 1∶15（g∶mL），提取温度50 ℃，提取时间2.0 h，超声提取辅助加热功率为450 W，超声温度50 ℃，超声时间40 min，刺玫果实提取物中的总黄酮提取率为128.6 mg/g。

2 黄酮类化合物的分离纯化

采用酶辅助超声波萃取的粗提物，其组分非常复杂，可能会影响后续八宝景天总黄酮的抗氧化、抑菌活性研究。另外，粗提物中总黄酮的相对含量偏低，不能满足后续试验的要求。因此，需对粗提物进行提纯处理。为了得到较高的纯度，在分离纯化过程中，一般都会使用大孔树脂吸附的方法以得到更高纯度的提取液。

大孔树脂吸附法与其他吸附法相比，大孔树脂的吸附提纯能够在每单位质量的物质上提供更大的总面积（比表面积），并具有更大的吸附容量、更好的选择性、更快的吸附速度等诸多优点。大孔吸附树脂是一类具有高选择性、高稳定性的固体分离材料。大孔树脂特殊的三维立体多级孔结构，增大了分粗提取液与大孔吸附树脂之间的接触面积，使其具有更大的范德华引力，并可形成更多的氢键作用，这样可以将来自极低浓度溶液的目标有机物质进行吸附。由于大孔树脂在3D 空间中具有不同尺寸的立构孔道，使其在溶液流经大孔树脂时，不同分子在孔道中的穿透力存在较大差异，进而影响其对溶液的吸附速度。在利用大孔树脂对粗提取液纯化的过程中，可以将具有不同吸附力和不同分子量尺寸的有机化合物吸附在树脂上，然后用不同的溶剂洗脱，从而实现精细的分离和提纯[18]。

2.1 大孔树脂的分类及常见型号

将大孔树脂按照其极性大小及所选择的小分子与分子间以共价键结合形成聚合物的小分子结构的区别，将其划分为三大类：非极性大孔吸附树脂、极性大孔吸附树脂，以及中极性大孔吸附树脂[19]。大孔树脂的种类繁多，而且每一种树脂的型号都不一样，不同类型和型号的大孔树脂，其吸附特性也会有很大的差异。目前，我国有南开大学化学研究所生产的AB、D、H 系列，上海制药研究所生产的SIP系列等。

2.1.1 非极性大孔树脂

非极性大孔吸附树脂又被称为芳香性吸附剂，如苯乙烯，二乙烯苯等，有很小的转矩用来收集单倍体。由于其主链结构中不含有任何功能性碱基，因此非极性大孔树脂表面具有较强的疏水性，但对有机溶剂中的疏水性组分具有较强的吸附能力。最适宜的是在极性溶剂中对非极性物质（如水） 进行吸附，而在极性溶剂中对小分子的疏水性部分则会产生分子作用。在实验室中常用的模型有XAD-1600，D-101，D3520，HP-20，CAD-40 等[20]。

2.1.2 中等极性大孔树脂

中极性大孔树脂是以多官能团的甲基丙烯酸酯作为交联剂的一种含有酯基的大孔树脂，将其包裹在含醚基的整体中，并与多孔层相结合，其表面包括排水和剖面两部分。中性多孔吸附树脂可以从极性溶液中吸收非极性物质，也可以将非极性溶液中的大多数极性物质吸出，还可以将其作为脂族吸附剂，如聚丙烯酸酯类聚合物。中极性大孔树脂在工业上有着广阔的应用前景。试验中较常用的大孔树脂类型有LX-28，ADS-45，BS-45，BS-45，BS-45，BS-45，BS-75 等[21]。

2.1.3 极性大孔树脂

极性大孔树脂（Polymer porous gap resin） 主要由含有酰胺基、氰基、酚羟基的树脂组成，其中有的树脂还可利用静电作用对极性物质进行吸附，如丙烯酰胺。XAD-10、XAD-11、AD-12、NAK-9、DouliteXAD-761 等[19]都属于极性大孔树脂。

2.2 大孔吸附树脂在总黄酮纯化中的应用

侯梦阳等人[7]采用比较试验对NKA-9、HPD100、HPD400、HPD600、AB-8、D101、X-5、DM301 等型号的大孔吸附树脂的制备及其对玳玳花总黄酮的吸附、解析力进行了测定，得出AB-8 型的提纯效果最好；杨永涛[8]以3 个主要的孔解吸附速率树脂为主要原料，通过对6 中树脂（AB-8、D101、S-8、X-5、HPD-500NKA-9） 的吸附速率的比较，从罗布麻中筛选出高效的HPD-500 树脂。荆常亮[9]的研究表明AB-8 型大孔树脂是从草本植物中提取和提纯总黄酮的最好方法，其纯度可达79.62%。邓梦琴[10]用NKA 型大孔树脂对菠萝蜜中的总黄酮进行富集纯化，其总黄酮含量从16.74%上升到了84.42%。敬思群[11]使用AB-8 型大孔树脂对昆仑雪菊中的总黄酮进行了分离纯化，结果表明，总黄酮含量由28.12%增加到52.43%，增加了86.5%。王雯[12]用D-312 型大孔树脂对化橘红中总黄酮进行了分离纯化，结果表明化橘红中总黄酮的含量从14.16%上升至53.5%，在此基础上优化了上样溶液pH 值为4、吸附流速1.0 mL/min 的洗脱条件下，pH 值为7，洗脱流速为1.0 mL/min，洗脱溶液体积含量为80%。库咏峰[13]通过对9 种不同型号大孔树脂的静态吸附以及动态吸附的比较，发现HPD-500 型大孔树脂的吸附性能比其他类型大孔树脂更好，能够使肉桂中总黄酮的提取率达到91.81%。林志钦[14]使用X-5 型大孔树脂，对莲子芯中的总黄酮化合物进行了分离与纯化，并确定了其最佳提纯工艺：上样质量浓度5.1 mg/mL，上样pH 值6，上样流速为物料的2 倍体积每小时，上样量为物料的2 倍体积，洗脱剂体积分数为50%的乙醇，洗脱流速为物料的2 倍体积每小时，洗脱剂用量为4 倍体积。

3 总黄酮的生物活性

3.1 抗氧化活性

黄酮类物质具有与其他抗氧化剂相似的抗氧化机制，其主要机制是产生氧原子，然后氧化生成多酚自由基。其氧化产物相对稳定，不容易被其他大分子所破坏，且具有良好的金属络合作用。这类化合物具有高度的离域性质、完备的的大π 键共轭体系，强配体和适宜的立体结构等特点，是一类非常理想的金属离子配体。已有的研究表明，类黄酮金属络合物可显著提高材料的抗氧化性。黄酮不但能抑制脂肪氧酶和NADH 氧化酶等酶的活力，起到抗氧化效果，还能使黄酮类化合物的抗氧化性能得到全面提高。梁证等人[22]采用AB-8 型大孔树脂提纯了仙人掌的果皮和果肉中的总黄酮，证明了仙人掌的抗氧化性。杨永涛[23]对罗布麻中总黄酮的大孔树脂纯化物产物的抗氧化性进行了研究，结果显示，大孔树脂纯化产物对DPPH·，·OH，O2-·，ABTS+·等都有一定的清除作用，其抗氧化性比总黄酮粗提物强。吴婕等人[24]研究结果显示，在甜茶叶中总黄酮的质量浓度相同的情况下，经提纯后的总黄酮对ABTS+自由基的清除率降低了28.6%，结果表明，经大孔树脂纯化后的甜茶叶总黄酮具有更强的抗氧化能力。王寒冬[25]研究发现，DM130 型大孔树脂对赶黄草黄酮具有较强的DPPH 自由基清除能力，并具有较强的还原能力。

3.2 抑菌活性

杜银香等人[26]采用大孔树脂法从华中枸骨叶中分离得到了一种有效成分，初步证明该成分具有一定的体外抗菌活性，且随着该成分的含量的增加，其抗菌活性也随之增强。赖谱富等人[27]在研究过程中，采用大孔树脂分离纯化了多年生藤本豆的总黄酮，结果表明，多年生藤本豆的总黄酮抗菌活性随其浓度的增大而增大。孙丹丹[28]在试验中发现，冻绿叶黄酮溶液种类相同的情况下，不同浓度的冻绿叶黄酮溶液的抑菌效果有明显差异。龙旭等人[29]研究表明，丹参总黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有较强的抑菌效果，且对革兰氏菌也有较强的抑菌效果，但在相同浓度丹参总黄酮的条件下，其抑菌效果具有明显的大小差异：大肠杆菌＞金葡菌＞绿脓杆菌，说明丹参总黄酮对细菌有较好的抑制作用。刘芮等人[30]在前期工作中发现，银杏黄酮提取物可延长3 种致病菌（金葡菌、大肠杆菌和丙二酸盐克罗诺杆菌） 的感染延迟期，银杏黄酮作用8 h 后，3 种致病菌细胞破裂，内容物泄露；3 种致病菌在银杏黄酮提取物处理4～12 h 后，其3 种致病菌菌液中的AKP 酶活性明显升高；银杏黄酮可是病原菌细胞内活性氧（ROS） 升高，表明其可能是病原菌细胞形态发生改变，使其失去存活能力。邵方宣[31]的研究表明，北橐吾总黄酮溶液在处理3 h后，能够与Ecolid 的细胞成分相结合，破坏其细胞壁及细胞膜的完整性，引起Ecoli 细胞形态的显著改变。另外，北橐吾总黄酮还能改变Ecoli 细胞膜的渗透性，严重时会将Ecoli 细胞膜彻底破坏，造成Na+、K+、DNA 等物质的大量外流，试验总结了黄酮类化合物的抗菌活性，黄酮类化合物能够通过干扰细菌体内DNA 的作用，影响体内的氧化还原反应的平衡状态，甚至会破坏目标菌的细胞膜，改变细胞膜的通透性及细胞中ROS 含量等，从而起到抑菌的效果。

4 结语

拟利用Box-behnken 试验设计，通过双酶辅助超声波的方法，以八宝景天中总黄酮类化合物为研究对象，在降低其他因素干扰的同时，得到最佳的提取工艺，并极大地提高了总黄酮成分的提取率。通过对大孔树脂吸附、分离和提纯工艺的研究，不仅可以提高总黄酮的纯度，还能够去除粗提物中的杂质，也能增强总黄酮的生物活性。近年来，随着总黄酮化合物的提取和分离，以及对总黄酮化合物抗氧化和抑菌作用的研究，得到了广泛的关注和深入，对八宝景天总黄酮的提取方法、大孔树脂的纯化方法及经纯化后的总黄酮抗氧化和抑菌活性进行了综述，以期为今后八宝景天总黄酮化合物的开发和利用提供一定的参考。