人体内微生物游离DNA在病原微生物检测中的应用

江婷婷，林彦锋 综述 李 鹏，宋宏彬 审校

感染性疾病是人类健康的重大威胁，目前可导致人类感染性疾病的微生物超过1 000种[1]。然而，目前只有少数的病原体可以识别出来。微生物分离培养是感染性疾病诊断的金标准，且许多常见的病原体难以培养[2]。PCR等分子生物学检测只适用于有限的已知病原体诊断[3-4]。宏基因组测序已广泛应用于已知或未知病原体的鉴定[5-6]，但该技术依赖于采集感染部位的样本[7]。

游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)是指游离于细胞外的部分降解了的DNA，于1948年首次在癌症患者的血清中发现[8]，已用于肿瘤检测[9]、无创产检[10]、器官移植[11]等。cfDNA高度片段化，长度大部分在100～200 bp之间[12]。cfDNA存在于外周血循环中，主要来源于人的基因组DNA、线粒体DNA[13]。血液中还存在微生物来源的cfDNA(microbial cell-free DNA，mcfDNA)，其长度短于人源cfDNA，为40～100 bp[14]，侵入性病原体通过微生物的易位及感染或在机体出现物理损伤时进入血液[15]。

基于cfDNA的液体活检在临床感染实时诊断中表现出巨大应用价值，在败血症[16]、寄生虫[17]和结核病[18]等病原检测中表现出可靠的识别能力，研究者们针对多种病原体及不同类型样本开展了相关工作。

1 mcfDNA用于细菌性感染检测

1.1 血液样本血流感染是临床上众多挑战之一，在许多病例中预后较差，会导致败血症甚至死亡，病原体的早期识别有助于降低患者的病死率。一项前瞻性研究表明，256份脓毒症发病时血培养样本的阳性率为33%，而基于mcfDNA二代测序的病原体鉴定阳性率则为72%[19]。基于mcfDNA测序，Chen et al[20]通过对正常样本和败血症样本检测的细菌构建共生网络，从有限的败血症样本中鉴定出引起败血症的目标细菌。研究[21]还发现，病原体cfDNA持续可检测的时间跨度明显长于传统的病原分离培养，且其持续时间与转移性感染风险增加有关。对复发性或难治性的儿科肿瘤患者的临床血样进行cfDNA测序，Goggin et al[22]发现在感染症状出现的3日前就可在患者血液中检测到病原体的cfDNA序列，检测灵敏度和病原序列数随时间推移而升高，对常见血流感染病原体的特异性达到91%。

此外，基于血液样本的cfDNA也能用于识别非血流感染的原位感染病灶病原体。Echeverria et al[23]对53名确诊为髋关节或膝关节假体感染的血液样本进行cfDNA测序，将病原体检测率从87%提高到94%，并发现了传统分离培养方法无法获得的14种微生物。重症肺炎患者的下呼吸道样本不易获取，研究者通过对患者外周血进行cfDNA检测，在67%(12/18)的病例中检测到一种或多种肺炎病原体，并得到临床确认[24]。通过比较囊性纤维化患者和健康志愿者的血液cfDNA测序结果，发现71%的患者血液中存在呼吸道病原体的cfDNA，且丰度在统计学上显著高于健康对照组[25]。

肺结核早期诊断对治疗极为关键，但传统方法难以对病原体进行及时检测。Pan et al[26]发现cfDNA可以作为检测肺结核免疫相关的微生物标志物，与使用单核细胞-淋巴细胞比率来检测肺结核相比，基于cfDNA检测肺结核的灵敏性和特异性分别提高到79.2%和84.2%。此外，临床上从培养物收集到确认结核分枝杆菌的检测时间中位数平均为41 d，而基于cfDNA的检测可将总时间缩短为4 d左右，显著提升了检测时效性[27]。

1.2 其他体液样本mcfDNA也广泛存在于尿液、胸腔积液、肺泡灌洗液、脑脊液等其他类型人体体液样本中。研究者通过识别73例尿液样本中肺结核特异性的mcfDNA片段，表明该方法的特异性达到100%[28]。此外，cfDNA测序结果中还包含细菌组成、抗菌素敏感性等信息，从而可对临床抗菌药物敏感性进行评估[29]。结合临床患者信息，cfDNA测序还可用于评估患者所患疾病的严重程度。Cheng et al[30]对肾移植受体的尿液进行cfDNA测序分析，发现cfDNA来源的宿主组织和细胞类型与患者感染状态密切相关，并确认肾脏和膀胱组织损伤与细菌感染相关。

基于mcfDNA的检测方法对于传统方法难以检测的细菌具有重要意义。临床结核性胸膜炎诊断极具挑战，Che et al[31]对患者胸腔积液样本同时进行传统方法检测和cfDNA检测，结果发现后者对结核分支杆菌检测的敏感性为75%，特异性则达到100%，显著高于传统分离培养和Xpert检测方法。肺炎克雷伯菌易导致肺炎，胸腔积液中的肺炎克雷伯菌的临床分离培养较为困难。Ren et al[32]建立了基于mcfDNA的肺炎克雷伯菌感染检测系统，与痰培养结果相比，该检测方法的敏感性及特异性分别为91%、95%以上，其阳性检出率也远高于传统检测，为临床诊治提供了重要指导。

2 cfDNA用于真菌性感染检测

侵入性真菌感染在临床日趋常见，但真菌分离培养较为困难，且不易分离破壁，宏基因组测序也难以检出。毛霉病是一种罕见的真菌感染引起的疾病，Martin-Blais et al[33]基于血液样本的mcfDNA测序确诊了1例侵入性胃肠毛霉病，同时该方法还可以检出烟曲霉菌等其他丝状真菌[34]。研究者通过对真菌感染患者的血液样本进行mcfDNA二代测序，与通过肺组织、胰腺假性囊肿液和头皮伤口等侵入性检测结果一致[35]。Hong et al[36]对9例经培养证实真菌感染的患者血液进行mcfDNA测序，在其中7例患者中检测到真菌，也与活检组织鉴定结果相同。mcfDNA还可用于浸润性霉菌感染的检测，敏感性为79%，阳性预测值则达到100%[37]。与传统的检测方法相比，mcfDNA可有效识别多种类型的真菌感染。基于二代测序，Yan et al[38]对34例疑似败血症患儿的血液样本进行mcfDNA检测，发现耶氏肺孢子虫等19种潜在的致病性真菌。以上研究说明基于mcfDNA测序可以用于临床指导真菌性感染病原体的检测。

3 cfDNA用于寄生虫性感染检测

目前，临床上主要通过对患者的血液、组织液、排泄物、分泌物或活体组织等来检查寄生虫，检出率低，轻度感染者需要反复检查，且不适用于异位寄生的寄生虫感染。肺泡棘球蚴病是由多房棘球绦虫幼虫引起的严重的寄生虫病，研究者分析了149例血浆样本的cfDNA序列，发现在术前诊断为肺泡棘球蚴病患者血浆中含有不同棘球绦虫特异性序列，而在术前诊断为非肺泡棘球蚴病患者和健康志愿者均无相应序列，且棘球绦虫特异性cfDNA序列数量与肺泡棘球蚴病病变严重程度相关，从而为治疗后患者恢复的定量评估提供重要参考[18]。此外，研究者还发现疟疾患者总血浆中cfDNA水平随疾病严重程度的增加而升高，这为寄生虫感染的识别和病症严重程度判断提供了新的依据[39]。Zhao et al[40]收集了9例囊性棘球蚴病患者治疗前后的血液样本并测序，发现棘球绦虫cfDNA浓度及片段大小发生显著变化，治疗后浓度及片段长度均增加，这表明mcfDNA也可作为评估患者恢复情况的潜在标志物。血吸虫病的诊断主要通过对宿主的粪便或尿液标本中寄生虫虫卵进行检测，但不易检出轻度及早期活动性感染。研究者通过聚合酶链式反应，对血吸虫感染区域的人群体液样本进行血吸虫cfDNA检测，发现该方法的敏感性为100%，表明血吸虫cfDNA具有作为指示活动性血吸虫感染标志物的巨大潜力[41]。

4 cfDNA用于病毒性感染检测

病毒是引起呼吸道感染性疾病的常见病原体之一，早期准确地识别病原体可以减少抗感染药物的滥用。Munjal et al[42]基于mcfDNA检测，在1例患者的血浆中检测出爱泼斯坦-巴尔病毒的存在。说明cfDNA的检测可以为临床实践提供重要的信息。高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是引起鳞状细胞癌的主要因素，HPV-cfDNA从原发肿瘤脱落到体循环中，通过cfDNA的液体活检可以在治疗和随访期间进行连续采样，从而在早期疾病和治疗后疾病进展中监测HPV-cfDNA，具有高敏感性，可以用作筛查测定[43]。另外cfDNA可作为损伤的生物标志物，预测冠状病毒感染的临床结局[44]。综上，基于cfDNA的检测可以早期识别病毒性感染，并有效改善预后。

5 cfDNA用于其他病原体感染检测

临床对细菌、真菌、寄生虫以外的其他病原体检测能力极为不足，主要依赖症状出现后的筛查与对症治疗。Centeno et al[45]对10例伤寒立克次体感染患者采用mcfDNA测序，发现检测的特异性达到100%，高于血清学检测。Branda et al[46]对患者血浆中的伯氏疏螺旋体进行检测，发现mcfDNA检测的灵敏度为64%，显著高于PCR(7%)及血清学(50%)检测结果，联合cfDNA和血清学检测可将灵敏度提高到86%。Karius检测是基于mcfDNA二代测序的非侵入性血液测试，可鉴定1 000多种细菌、DNA病毒、真菌和寄生虫，国外已应用于临床。Branda et al[46]采用Karius定量微生物检测cfDNA方法，对游走性红斑患者的血浆样本进行分析，检测到伯氏疏螺旋体及其他两种媒介传播的病原体：立克次体和土拉杆菌，后续对1例对照受试者进行土拉杆菌血清学检测，结果为强阳性。

6 展望

作为一种微创快速的检测病原方法，cfDNA日益广泛用于感染性疾病病原检测，成为临床重要的辅助手段。病原体cfDNA从感染部位释放到非侵入性样本(如外周静脉血、尿液等)中，其采样过程相对无创，且实验过程不需裂解细胞、检测周期短，也可对多病原混合感染进行识别。结合纳米孔测序可进一步缩短mcfDNA检测周期，使得临床快速识别病原体成为可能。对不同测序平台中cfDNA识别病原体的能力进行评估，结果表明二代测序的敏感性和特异性可达到79%和91%，但检测周期需要24 h以上，纳米孔测序对细菌的敏感性和特异性分别达到75%和81%，且可在6 h内完成病原体鉴定。在血流感染发生前就可以检出病原cfDNA序列，即使是抗生素治疗后仍然可以检出，这为临床感染的早期预警和筛查提供了重要参考。

样本的cfDNA容易受到污染和干扰，测序分析对背景信号的降噪要求很高，通过对低生物量背景进行校正可提高检测效果。此外，样本采集及处理中的多个因素也会给cfDNA检测灵敏度带来影响，如：采样管或尿液防腐剂的类型，样本延迟处理，核酸提取试剂盒的选择等，通过优化样本前处理方式及更高效的核酸提取方法对cfDNA的检测至关重要。现有的病原微生物的数据库的完整性、数据更新速度和频率等也影响基于cfDNA的病原检测。同时，cfDNA作为一种短片段DNA，依赖二代测序平台，测序成本高且检测周期仍相对较长。纳米孔测序对短片段检测的数据量和准确性仍有一定局限，但相对于二代测序成本较低，且具有实时性。随着纳米孔测序技术的发展，短片段模式的开发，使得纳米孔测序用于cfDNA检测具有了可行性。随着各种测序平台技术与多种扩增等样本处理方法的发展，cfDNA在临床感染性疾病的诊断中将会发挥更重要的作用。