反应条件对赖氨酸-壳寡糖美拉德反应产物抗氧化性的影响及其抑菌性研究

文俊仁，卢静静，文 静，孙炜炜

（1. 武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北武汉 430205；2. 武汉黄鹤楼香精香料有限公司，湖北武汉 430050）

0 引言

美拉德反应是一种自然发生于食品加工和储存过程中的非酶促褐变反应，是食品香味和色泽产生的方式之一，该反应可以使食物得到诱人的色泽、浓郁的芳香和特有的滋味。美拉德反应产生的还原酮、类黑精等杂环化合物会影响食品的颜色、风味及营养价值[1]，研究发现美拉德反应产物（Maillard Reaction Products，MRPs） 还具有抗氧化性、抑菌性等生物活性[2]，同时还能够延缓机体衰老、帮助清除自由基、抑制癌细胞增殖[3]，对于人体健康和防治疾病有重要意义，可作为新型天然抗氧化剂取代化学合成类抗氧化剂应用于食品中，防止食物变质。

壳寡糖是一种含有游离氨基的碱性多糖，天然无毒副作用，有良好的溶解性、抗氧化性和抗菌活性，还可以降低人体血脂水平，增强免疫力[4-5]；分子中存在大量活性基团，不仅可以和蛋白质发生美拉德反应，也可以与糖发生美拉德反应，优化其生物活性，在食品药品领域具有广阔的应用前景。因此，以赖氨酸和壳寡糖为原料制备美拉德反应产物，探究反应温度、反应时间、反应pH 值和赖氨酸与壳寡糖摩尔质量比等反应条件对美拉德反应产物褐变程度和抗氧化性的影响，并对优化产物的抑菌性进行研究，旨在为美拉德反应产物在食品防腐剂中的应用提供一定理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳寡糖，山东奥康生物科技有限公司提供；赖氨酸，南京都莱生物技术有限公司提供；冰乙酸、无水醋酸钠、盐酸、氢氧化钠、硫酸亚铁、硫酸、TPTZ 等，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

722 型紫外可见分光光度计，天津冠泽科技有限公司产品；AL104 型分析天平，梅特勒—托利多仪器（上海） 有限公司产品；LX-B75L 型立式压力蒸汽灭菌锅，成都宜恒实验仪器有限公司产品；HHS2 型恒温水浴锅，郑州市亚荣仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验

（1） 反应温度对美拉德反应产物褐变程度和抗氧化性的影响。将赖氨酸与壳寡糖以摩尔质量比1∶1称取，用蒸馏水溶解后，定容至100 mL，用缓冲溶液调节溶液pH 值为8，取10 mL 反应液置于试管中，分别于80，90，100，110，120 ℃条件下恒温反应90 min，考查反应温度对美拉德产物褐变程度及抗氧化性的影响。

（2） 反应时间对美拉德反应产物褐变程度和抗氧化性的影响。将赖氨酸与壳寡糖以摩尔质量比1∶1称取，用蒸馏水溶解后，定容至100 mL，用缓冲溶液调节溶液pH 值为8，取10 mL 反应液到试管中，于100 ℃下分别反应30，60，90，120，150 min，考查反应时间对美拉德产物褐变程度及抗氧化性的影响。

（3） 反应pH 值对美拉德反应产物褐变程度和抗氧化性的影响。将赖氨酸与壳寡糖以摩尔质量比1∶1称取，用蒸馏水溶解后，定容至100 mL，用缓冲溶液调节溶液pH 值分别为6，7，8，9，10，取10 mL反应液置于试管中，于100 ℃下反应120 min，考查反应pH 值对美拉德产物褐变程度及抗氧化性的影响。

（4） 赖氨酸与壳寡糖摩尔质量比对美拉德反应产物褐变程度和抗氧化性的影响。将赖氨酸与壳寡糖分别以摩尔质量比2.0∶1.0，1.5∶1.0，1.0∶1.0，1.0∶1.5，1.0∶2.0 称取适量，用蒸馏水溶解后，定容至100 mL，用缓冲溶液调节溶液pH 值为8，取10 mL 反应液到试管中，在100 ℃下反应120 min，考查反应物质量比对美拉德产物褐变程度及抗氧化性的影响。

1.3.2 正交试验设计

在单因素试验结果的基础上设计正交试验，探讨不同反应条件对赖氨酸-壳寡糖美拉德反应产物抗氧化性的影响，并筛选出最佳反应条件。

1.3.3 FRAP 测定

参照文献[6]的方法进行测定。

1.3.4 褐变程度

将反应得到的美拉德反应产物于波长420 nm 处测定吸光度，吸光度越大表示美拉德反应褐变程度越深。

1.3.5 抑菌性

将制备的美拉德反应产物进行梯度稀释，得到不同浓度的稀释液。采用牛津杯法通过测定抑菌圈大小，研究美拉德反应产物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用。

2 结果与分析

2.1 赖氨酸与壳寡糖美拉德反应条件对抗氧化性的影响

2.1.1 反应温度对美拉德反应产物性质的影响

反应温度对美拉德反应产物褐变程度及抗氧化性的影响见图1。

图1 反应温度对美拉德反应产物褐变程度及抗氧化性的影响

由图1 可知，随着反应温度由80 ℃升高至110 ℃，美拉德反应产物褐变吸光度由0.082 升至0.356，FRAP 值由2.22 升至3.38，温度升高能够提高美拉德反应的速率，使体系快速生成大量的还原酮和类黑色素等化合物，使反应产物的褐变程度加深，该类物质具有还原力和金属离子螯合力[7]，因此FRAP 值增大，抗氧化活性增强；继续升高反应温度至130 ℃，产物的褐变程度及抗氧化活性均呈现下降趋势，可能由于还原酮及类黑素等化合物在过高的温度下会发生分解，造成抗氧化活性降低。因此，在110 ℃时制备的美拉德反应产物，褐变程度和抗氧化活性最强。

2.1.2 反应时间对美拉德反应产物性质的影响

反应时间对美拉德反应产物褐变程度及抗氧化性的影响见图2。

图2 反应时间对美拉德反应产物褐变程度及抗氧化性的影响

由图2 可知，随着反应时间的延长，美拉德反应产物褐变吸光度及抗氧化性均呈现先增加后减弱的趋势，在反应时间为120 min 时，褐变及抗氧化活性均达到最大值。可能由于反应时间延长，壳寡糖与赖氨酸经脱氢、缩合、分子重排生成的还原酮及类黑素等化合物逐渐积累增多，产物褐变及抗氧化活性增强，高温反应时间太长，生成的化合物容易降解减少，造成抗氧化活性降低。因此，反应时间为120 min 时，所得美拉德产物具有最强的抗氧化能力。

2.1.3 反应pH 值对美拉德反应产物性质的影响

反应pH 值对美拉德反应产物褐变程度及抗氧化性的影响见图3。

图3 反应pH 值对美拉德反应产物褐变程度及抗氧化性的影响

由图3 可知，随着反应pH 值的增大，美拉德反应产物的抗氧化性呈先增大后减小的变化趋势，当反应pH 值从6.0 上升至8.0 时，产物褐变吸光度由0.078 升至0.371，FRAP 值由2.16 升至3.25，褐变程度和抗氧化活性增强，这可能是由于美拉德反应是一种碱催化反应，反应pH 值增大碱性增强，体系中游离氨基的浓度增大[8]，利于类黑素等化合物的生成，抗氧化活性增强；pH 值继续增大至10，产物褐变程度和抗氧化活性减弱，可能由于赖氨酸等电点pI 为9.74，当反应pH 值大于pI 时，赖氨酸呈阴性，可通过遮蔽正电基团间的相互作用减少氨基酸与多糖的相互作用[9]，生成的类黑素等化合物减少。因此，反应pH 值为8.0 时，褐变程度和抗氧化活性均最大。

2.1.4 赖氨酸与壳寡糖摩尔比对美拉德反应产物性质的影响

反应物摩尔质量比对美拉德反应产物褐变程度及抗氧化性的影响见图4。

图4 反应物摩尔质量比对美拉德反应产物褐变程度及抗氧化性的影响

由图4 可知，当增加反应体系中壳寡糖含量时，美拉德反应产物的褐变程度及FRAP 值均增大；当n赖氨酸∶n壳寡糖为1∶2 时，产物的FRAP 值最高，抗氧化活性最强，这可能是由于赖氨酸的自由氨基含量较高，当壳寡糖含量较低时，较多的自由氨基处于游离状态而不能发生反应，适当增加壳寡糖含量，游离羰基增多，更多的氨基参与美拉德反应，生成较多的美拉德反应产物，褐变程度增加。因此，赖氨酸与壳寡糖摩尔质量比为1∶2 时，所得美拉德产物具有最强的抗氧化能力。

2.1.5 正交试验

根据单因素试验结果, 选择反应时间、反应温度、反应pH 值和赖氨酸与壳寡糖摩尔质量比4 个因素的较优水平，按L9（34）设计正交试验。

正交试验结果见表1。

表1 正交试验结果

对以上正交试验结果进行极差分析可知，4 个反应条件对美拉德反应产物抗氧化性影响的主次顺序为B＞A＞C=D，即反应温度影响最大，其次为反应时间，反应pH 值和赖氨酸与壳寡糖质量比对产物抗氧化性的影响较小。由表1 的值分析可知美拉德反应产物抗氧化性最强的制备条件组合为A3B3C2D1，该组合为试验9，因此无需验证试验，说明在A3B3C2D1条件下反应得到的美拉德反应产物抗氧化性最强，即反应时间150 min，反应温度120 ℃，反应pH 值8，赖氨酸与壳寡糖质量比= 1∶1，在此条件下反应所得的美拉德反应产物抗氧化性最强，其FRAP 值为4.31。

2.2 美拉德反应产物抑菌性研究

利用上述所得最优反应条件制备美拉德反应产物，利用牛津杯法通过测量抑菌圈直径对其抑菌性进行研究。

美拉德反应产物稀释梯度对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌圈直径的影响见表2。

表2 美拉德反应产物稀释梯度对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌圈直径的影响/mm

由表2 可知，赖氨酸与壳寡糖美拉德反应产物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌圈，同浓度下其对枯草芽孢杆菌的抑菌圈较大，金黄色葡萄球菌的抑菌圈次之，对大肠杆菌抑菌圈不明显。3 种供试菌中，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，大肠杆菌是革兰氏阴性菌，说明该美拉德反应产物对革兰氏阳性菌有抑菌作用，对革兰氏阴性菌基本无抑菌效果。随着美拉德反应产物稀释倍数的增大，其对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力逐渐减弱。当产物稀释至10-4时，产生的抑菌圈直径均小于抑菌性判断标准的（7 mm），说明在此梯度下美拉德产物没有抑菌性，故最小抑菌浓度为10-4。

3 结论

以赖氨酸和壳寡糖为原料制备美拉德反应产物，通过单因素试验及正交试验考查反应温度、反应时间、反应pH 值和赖氨酸与壳寡糖摩尔质量比等反应条件对美拉德反应产物褐变程度和抗氧化性的影响，得到美拉德反应的最佳制备条件为反应时间150 min，反应温度120 ℃，反应pH 值8.0，n赖氨酸∶n壳寡糖=1∶1，在此条件下制备的美拉德反应产物抗氧化性最强，FRAP 值为4.31；该美拉德反应产物对大肠杆菌无抑菌作用，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，且美拉德反应产物溶液的最小抑菌浓度为10-4；说明赖氨酸和壳寡糖美拉德反应产物具有较好的抗氧化性，对革兰氏阳性菌有一定的抑菌效果，为美拉德反应产物在食品防腐剂中的应用提供一定理论支持。