高良姜多糖提取工艺的优化及抗氧化活性研究

王 艺，刘思思，张彤赫，黄儒强

（华南师范大学生命科学学院，广东广州 510631）

高良姜生长于热带、亚热带地区，为姜科植物，别名风姜、小良姜、良姜等，在我国的广东、广西、海南等地都有分布[1]，其干燥根茎可以入药，为药食同源植物之一[2]，并且营养成分丰富。现代药学研究表明高良姜具有抗菌、抗氧化、散寒止痛等功效[3]。

近年来，多项研究结果显示，许多植物多糖具有多种生物活性[4]，如免疫调节、抗菌、抗肿瘤、降血脂和护肝等作用[5]。植物多糖可通过激活超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶来有效地清除自由基[6]。研究发现，罗平小黄姜多糖清除DPPH 自由基的IC50为0.96 mg/mL[7]；生姜多糖清除DPPH 自由基的IC50值可达0.42 mg/mL[8]；大高良姜多糖质量浓度与抗氧化能力呈相关性，其IC50分别为2.21 mg/mL 和2.15 g/mL[9]；高良姜多糖清除DPPH自由基有效质量浓度（EC50） 为0.59±0.01 mg/mL，清除羟自由基EC50为0.05±0.003 g/L，螯合铁离子能力的EC50为2.75±0.20 g/L[10]。

选取热水提取法浸提高良姜多糖，以响应面法对提取工艺进行优化，在此基础上，以清除DPPH自由基及ABTS 自由基的能力和还原力为指标评价高良姜多糖的抗氧化活性。旨在充分开发利用这一宝贵的药食两用保健植物，为丰富发掘应用高良姜资源提供更多的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干燥高良姜根茎，购自农贸市场；葡萄糖标准品，上海源叶生物科技有限公司提供；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SFG-02B600 型电热恒温鼓风干燥箱，黄石市恒丰医疗器械有限公司产品；5804 R 型台式高速冷冻离心机，艾本德中国有限公司产品；VIS-723N 型可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司产品；RE-52AAA 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 高良姜粗多糖的提取与纯化

（1） 粗多糖的提取。热水提取法[11]：粉碎干燥的高良姜，60 目过筛，得干粉。称取一定量的干粉，根据液料比加入定量的蒸馏水，恒温振荡器中提取一定时间，抽滤，将滤液旋转蒸发浓缩到一定浓度，然后进行醇沉，得粗多糖。

（2） 粗多糖除蛋白。采用Sevage 法[12]。

（3） 脱色。采用H2O2氧化法[13]。

1.3.2 多糖含量的测定

参考李承浩等人[14]的方法用苯酚- 硫酸法测定多糖含量。

1.3.3 高良姜粗多糖提取条件的优化

（1） 单因素试验。称取5.0 g 高良姜粉末，考查料液比、提取温度和提取时间对高良姜多糖提取率的影响，重复试验3 次。

（2） 响应面法优化试验。以单因素试验的结果为基础，明确3 个因素变量的范围，运用Desing Expert 10.0 软件进行三因素三水平Box-behnken 试验设计。每组做3 次平行试验，取平均值。

响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

根据公式拟合回归方程，并对回归方程进行方差分析。

1.3.4 抗氧化活性测定

（1） DPPH 自由基清除活性的测定。参考Huang X Q 等人[15]的方法。

（2） ABTS 自由基清除活性的测定。参考张乃珣等人[16]的方法。

（3） 还原力的测定。参考Oyaizu M[17]的方法。

2 结果与分析

2.1 高良姜多糖提取条件的优化

2.1.1 单因素试验结果分析

（1） 料液比对多糖提取率的影响。

料液比对多糖提取率的影响见图1。

图1 料液比对多糖提取率的影响

由图1 可知，高良姜多糖提取率在一定范围内与料液比呈正相关，可能是料液比的增大促进了多糖的溶出。但当料液比增至1∶40（W/V） 后，多糖的提取率增长趋于平缓，说明多糖大部分已溶出，此时提取过程已基本达到饱和。

（2） 提取温度对多糖提取率的影响。

提取温度对多糖提取率的影响见图2。

图2 提取温度对多糖提取率的影响

由图2 可知，当提取温度为50~90 ℃时，随着提取温度的升高，高良姜多糖提取率随之明显增大；而当提取温度为90~100 ℃时，多糖提取率没有明显变化。

（3） 提取时间对多糖提取率的影响。提取时间对多糖提取率的影响见图3。

由图3 可知，当提取时间为1.0~3.0 h 时，高良姜多糖提取率随时间增长显著增高；提取时长超过3.0 h 后，多糖提取率增加不再明显，此时多糖已基本完全提取。

图3 提取时间对多糖提取率的影响

2.1.2 响应面试验结果

根据试验因素水平表设计试验，每组试验重复3 次，取平均值。

响应面试验设计及结果见表2。

使用多元回归拟合表2 试验数据，得到料液比、提取温度、提取时间及多糖提取率（Y）的回归方程如下：

表2 响应面试验设计及结果

回归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析

该模型p＜0.000 1**达到极显著水平，表明回归方程模型具有高度显著性；失拟项不显著p=0.831 0（p＞0.05），表明该模型稳定性较好；决定系数R2=0.989 4，表明高良姜多糖提取率约98.94%是由独立变量决定的；校正决定系数R2Adj=0.975 8，变异系数CV=0.17%，表明该模型拟合度很高，能很好地模拟高良姜多糖真实提取率与各变量之间的关系。根据表3 回归模型的系数进行显著性分析可知，在一次项中X1达到显著水平（p＜0.05），X2、X3达到极显著水平；在平方项中，各回归系数均达到极显著水平，表明高良姜多糖的提取率与3 个因素之间存在明显的二次关系；交互项中X1X2、X1X3均未达到显著水平，而X2X3的回归系数则达到了极显著水平，说明提取时间与提取温度的交互作用对多糖的提取率有较大影响。

根据拟合回归方程，固定料液比、提取温度和提取时间中的任意一个因素为零水平，做出2 组交互项的响应面图，测验其对高良姜多糖提取率的效用。

料液比与提取温度的交互效应对高良姜多糖提取率影响的响应面见图4，液料比与提取时间的交互效应对高良姜多糖提取率影响的响应面见图5，提取温度与提取时间的交互效应对高良姜多糖提取率影响的响应面见图6。

图4 液料比与提取温度的交互效应对高良姜多糖提取率影响的响应面

图5 料液比与提取时间的交互效应对高良姜多糖提取率影响的响应面

图6 提取温度与提取时间的交互效应对高良姜多糖提取率影响的响应面

由图4 ~图5 可知，提取温度、提取时间与料液比交互作用的响应面曲面坡度较缓和，说明响应值受各变量变化的影响较小；提取时间与提取温度交互作用的响应面曲面坡度较陡峭，随着提取温度的升高及提取时间的延长，多糖提取率呈现出先急剧增加后缓慢下降的趋势，说明响应值受变量变化的影响较大。当提取温度为90~100 ℃，提取时间为2.9~3.3 h 时，多糖提取率较高。这与表3 回归模型系数所示含义相符合。

通过所得回归模型对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺条件为料液比1∶40.71（W/V），提取温度97.11 ℃，提取时间3.43 h，理论提取率为10.23%。考虑实际操作情况，将最佳提取工艺修正为料液比1∶41（W/V），提取温度97 ℃，提取时间3.5 h。在此修正条件下，实测提取率为10.28%，表明该回归模型具有较可靠的预测性能，对于指导生产实践具有一定的借鉴意义。

2.2 高良姜粗多糖纯化结果（脱蛋白、脱色）

高良姜多糖经Sevage 法脱蛋白后，按公式计算：

其脱色率为98.59%。

2.3 高良姜多糖抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH 自由基活性的检测

自由基调节细胞生长，并抑制病毒和细菌，但体内自由基增多（包括超氧阴离子、过氧化氢和NO） 会导致T 细胞损伤、免疫功能下降和衰老[18]。抗氧化剂有助于人体对抗由自由基损伤引起的氧化应激[19]。

高良姜多糖清除DPPH 自由基的能力见图7。

图7 高良姜多糖清除DPPH 自由基的能力

由图7 可知，在测定的质量浓度范围内，高良姜多糖对DPPH 自由基的清除能力呈现出明显的剂量依赖性，且当质量浓度为5 mg/mL 时，清除率达到了90.0%。经计算得高良姜多糖清除DPPH 自由基的EC50为1.412 mg/mL，由此可见高良姜多糖具有明显清除DPPH 自由基的能力。

2.3.2 清除ABTS 自由基活性的检测

高良姜多糖清除ABTS 自由基的能力见图8。

图8 高良姜多糖清除ABTS 自由基的能力

由图8 可知，高良姜多糖对ABTS 自由基的清除能力具有剂量依赖性。在质量浓度为5 mg/mL 时，清除率最高为61.9%。计算得出高良姜多糖清除ABTS 自由基的EC50为4.33mg/mL。由此可知，高良姜多糖清除对ABTS 自由基清除能力较弱。多糖关于自由基的清除率可能与多糖的硫酸根含量、单糖组成和糖苷键类型有关[20]。研究发现，影响生物活性多糖抗氧化活性的各种因素包括多糖偶联物，粗多糖提取物中的多糖混合物、多糖螯合离子，富含金属离子的多糖、多糖的化学修饰和多糖的结构特征等。

2.3.3 还原力的检测

高良姜多糖还原力见图9。

图9 高良姜多糖还原力

由图9 可知，在质量浓度为0.05~1.50 mg/mL时，高良姜多糖的还原力与质量浓度表现出良好的线性关系。当质量浓度为1.5 mg/mL 时，还原力最强，吸光度达到0.976。

3 结论

初步研究了高良姜多糖提取工艺的优化及其抗氧化作用。结果表明，采用响应面试验模型能较好的优化热水提取法提取高良姜多糖工艺，得到的较优工艺条件为料液比1∶41（W/V），提取温度97 ℃，提取时间3.5 h，在该工艺下实测得多糖提取率为10.28%。高良姜多糖清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的EC50分别为1.412 mg/mL 和4.33 mg/mL，在一定程度上均表现出浓度依赖性。而有关高良姜多糖的结构鉴定及抗氧化活性机理有待进一步研究。