晚期肝细胞癌的免疫疗法研究进展*

王 宇 李钊颖 李 爽 李 书 刘成海

1.上海市宝山区中西医结合医院 (上海， 201999) 2.上海中医药大学附属曙光医院肝病二科 3.上海市中医药研究院肝病所 4.成都中医药大学附属医院神经内科

原发性肝癌是全球常见的消化系统恶性肿瘤，其死亡率居恶性肿瘤第二位。晚期肝恶性肿瘤的治疗在常规放化疗、小分子靶向治疗的基础上，免疫疗法亦逐渐应用于临床。免疫疗法分为免疫检查点药物、细胞疗法、细胞因子治疗、癌症疫苗、溶瘤病毒等。我国原发型肝癌的主要病理类型分为三类：肝细胞癌、肝内胆管癌以及肝细胞癌-肝内胆管癌混合型肝癌，由于三者在组织学表现、发病机制治疗手段等方面均存在较大差异。本文主要从免疫学发病机制、治疗措施两方面讨论晚期肝细胞癌(HCC)的免疫疗法的最新研究进展。

1 常见肝细胞癌发生的病因免疫学机制

肝脏通过大量的细胞毒性CD8+T以及包括包括NK细胞、γδT 细胞、MAIT 细胞和iNKT 细胞的先天淋巴细胞群发挥免疫监视及调控的作用。但HCC作为典型的感染、炎症相关肿瘤,其通过肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、肿瘤相关中性粒细胞(TAN)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞(Tregs)和树突状细胞(DC)等细胞组分，以及细胞因子在肿瘤进展中发挥免疫耐受及逃避作用[1]。

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染是HCC最大的病因危险因素。HCC作为炎症相关的癌症，其发生涉及相关炎性细胞因子释放、免疫检查点对T细胞耗竭、相关信号通路的激活和不同亚群的免疫抑制细胞的作用[2]。HBV、HCV驱动肝癌发生的常见机制包括持续性肝脏炎症和抗病毒免疫反应受损、免疫和病毒蛋白介导的氧化应激以及病毒蛋白对细胞信号通路的失调[3]。HBV通过诱导程序性死亡受体-配体1(PD-L1)和人类白细胞抗原E(HLA-E)的表达，促进髓源性抑制细胞(MDSCs)及Tregs的分化，抑制DC的增殖及活化，耗竭T细胞从而使HBV感染得以慢性化，同时这些因素亦在HBV相关HCC的致病机制中扮演重要角色[4]。与HBV稍有不同，HCV促进肝细胞癌的发生方式在于炎性肿瘤微环境的形成，视黄酸诱导基因I受体(RIG-I)和Toll样受体3(TLR3)识别HCV并促进I型干扰素的产生；肝脏中持续的炎症环境与病毒蛋白的作用相结合，促进了与细胞存活相关的信号通路(例如 STAT3、AKT、NF-κB 和 FasR)持续激活。此外，STAT3在产生 IL-10的同时会促进Tregs的扩增以及MDSC的增殖发育。这种改变的免疫反应因PD-1和FasL的表达增加而进一步加剧，损害细胞毒性T淋巴细胞功能和诱导其凋亡[5]。因此，HCV导致的HCC是在炎症微环境诱发的一系列促肿瘤效应及免疫逃逸反应的基础上发生的。在慢性HBV、HCV感染损伤肝细胞的同时，肝祖细胞的活化和分化失调也促进了HCC的发生[6]。

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中肝小叶内增殖的肝内淋巴细胞群，如CD8+T细胞、Th 17细胞、NKT细胞和浸润性炎性巨噬细胞诱导促炎细胞因子如TNF-α和IL-6的分泌进而导致IKKβ、 NF-κB以及STAT3促癌通路的激活。炎性环境及促癌信号通路的激活均参与了肿瘤发病机制。另一方面，肠道微生物群的变化导致活性氧的产生，进而导致DNA损伤；肝星状细胞(HSC)、肝窦内皮细胞(LSECs)的激活和慢性肝再生伴随的染色体畸变均导致NASH 癌症发生的风险增加[7-9]。酒精相关性肝病是全球最常见的慢性肝病类型，其占HCC病因的30%。长期大量饮酒通过致癌醛、ROS、DAMP和 PAMP 的产生来促进肿瘤的发生，这些醛也会引起炎症反应、HSC的激活和免疫抑制。免疫抑制主要表现为，抗肿瘤 CD8+T细胞减少以及促肿瘤转录因子HIF1α上调[10]。

2 过继免疫CAR-T、TCR-T细胞疗法

肿瘤抗原需要与MHC I类分子结合然后递呈至肿瘤细胞表面，才可被CD8+T细胞毒性细胞识别。基于此，T细胞可以通过基因修饰在细胞表面表达肿瘤抗原识别的T细胞受体(TCRs)或嵌合抗原受体(CARs)，以提高免疫细胞的特异性和反应性。因而衍生了T细胞受体-T细胞(TCR-T)和嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)疗法。

TCR-T技术主要机制在于T细胞基因重新编辑后的重新赋能，使T细胞能够增强肿瘤细胞的TCR的识别亲和性，从而重新产生细胞毒作用。肝癌细胞表达过量的AFP抗原，针对AFP抗原的肝癌新型TCR-T疗法ADP-A2AFP共纳入了9例晚期肝细胞癌患者中：接受低剂量治疗的患者病情均未出现进展；在接受最高剂量的4名患者中一名患者获得已持续6个月以上的完全缓解；所有受试患者目前发生T细胞相关肝毒性[11]。亚洲80%的肝癌为HBV导致，HBV特异性TCR重定向的T细胞疗法(HBV-TCR-T细胞)，可靶向由乙肝病毒衍生的，在肝癌细胞表面表达的，通过HLA-I类分子呈递的抗原决定簇[12]。目前已有动物实验表明提高HBV抗原特异性亲和力TCR-T具有较高安全性及有效性[13]。但目前疗法尚不能达到针对肿瘤抗原的高度特异性，T细胞可能会大量损伤受HBV感染的细胞，从而发生肝衰竭[14]。并且，TCR-T的效果受限于TCR亲和力，过低则效力降低，过高则产生脱靶效应损伤正常组织。

CAR-T疗法是T细胞通过基因修饰使肿瘤特异性抗原识别结构域被靶向识别并能产生T细胞激活信号，使T细胞发挥肿瘤杀伤作用。磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)在肝癌检测中高表达，是HCC免疫治疗的靶点之一。在共纳入13例晚期HCC患者的I期临床GPC3-CART试验中，一名病情持续稳定的患者存活期为44.2个月，且CAR-T细胞扩增往往与肿瘤反应呈正相关，没有患者出现3-4级神经毒性[15]。IL-15和IL-21的转基因表达能增强GPC3-CART细胞对HCC的抗肿瘤特性[16]。CD147是癌细胞相关的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子，动物实验表明，CD147-CART靶向 HCC可以选择性地杀死双抗原(GPC3、CD147)肿瘤细胞[17]。MUC-1是一种可用作癌症的生物标志物和治疗靶标的跨膜糖蛋白，目前已有MUC-1阳性晚期难治性实体瘤患者MUC-1 CAR T细胞的Ⅰ/Ⅱ期研究(NCT02587689)。亦有靶向CEA阳性肿瘤肝转移的Ⅰ期临床研究，可由于CEA并非绝对特异性抗原，可能导致病人发生其他不良反应[18]。由于缺乏保持高度特异性肿瘤抗原，CAR-T细胞运输、增殖及活性的有限性及不稳定性，脱靶效应及细胞因子释放综合征等原因，CAR-T对于HCC治疗探索目前局限于低临床价值的I期临床试验及动物实验[19]。

3 NK及特殊T细胞疗法

NK免疫细胞疗法依然处于早期研发阶段。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)能在多种细胞因子的刺激下具备T淋巴细胞的抗原活性和NK细胞样肿瘤杀伤作用，直接杀伤肿瘤细胞也可以间接通过细胞因子、诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。韩国有文献报道，联合CIK治疗可使HCC复发率和死亡率降低大约37%和79%[20]。NK细胞可以通过释放穿孔素等细胞毒性颗粒、激活Fas与FasL等凋亡系统及与肿瘤细胞表面抗体结合发挥细胞毒性作用进而清除肿瘤细胞[21]。研究表明，NK细胞免疫疗法联合索拉非尼可提高HCC患者的生存率[22]。NK与KIR错配的同种异体NK细胞治疗可以使NK细胞能在短期内提高HCC患者的免疫功能[23]。NKT细胞可以通过激发多种细胞因子及直接细胞毒作用起到肿瘤抑制作用。我国的I期临床试验显示：自体iNKT细胞治疗安全且耐受性良好，扩增的iNKT细胞产生Th1样反应，可能具有抗肿瘤活性[24]。γδT细胞主要通过产生促凋亡分子和炎性细胞因子或通过依赖于抗原受体(TCR)的途径来调节抗肿瘤反应，但目前尚无高质量证据做支撑[25]。

4 免疫检查点抑制剂疗法

免疫检查点抑制剂(ICI)主要包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)抑制剂与PD-1抑制剂，作用于T细胞激活过程中的CTLA-4/B7-1/2和PD-1/PD-L1两个关键通路，激活T细胞对肿瘤细胞的免疫应答从而发挥抗肿瘤作用。晚期HCC的Ⅰ～Ⅲ期临床试验中结果显示，ICIs可单独或与靶向治疗或其他ICIs联合使用，单药治疗的应答率为15%～23%，联合治疗后可增加到30%左右[26]。美国国立综合癌症网络指南提出了免疫联合疗法(简称“T+A”方案)，“T+A”联合用药可使HCC死亡风险降低34%，中位生存期(mOS)为19.2个月[27]。《NEJM》报道的IMbrave150的完整数据中：阿特珠单抗联合贝伐珠单抗组患者12个月生存率，达到67.2%[28]。CTLA-4制剂可以使合并HCV的HCC疾病控制率达到76.5%，但缓解率仅为17.6%[29]。在CheckMate-040临床研究中，PD-1联合CTLA-4使HCC客观缓解率(ORR)达32%[30]。2021年10月17日阿斯利康宣布HIMALAYA研究：STRIDE疗法(tremelimumab+Imfinzi，即抗CTLA-4单抗+PD-L1单抗)用于一线治疗晚期肝细胞患者的Ⅲ期中对比索拉非尼达到了总生存期(OS)主要终点[31]。我国专家共识认为:基于协同增效的作用机制、治疗的便利性与较高的转化成功率，ICIs联合AATDs治疗值得作为晚期HCC的转化方案进行尝试，具体方案包括如帕博利珠单抗联合仑伐替尼、阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗、卡瑞利珠单抗联合阿帕替尼以及其他类似组合方案等[32]。但ICIs对HCC肝内肿瘤的治疗效应不及肝外病变，另外肺部转移性肝肿瘤对ICIs反应最好[33]，这或表明仍需要进一步提高ICIs在HCC中的特异性及适应“肝脏免疫耐受”的治疗效应。此外，ICIs可能通过活化的T细胞攻击正常肝组织、自身抗体的产生、CTLA-4脱靶效应导致的ADCC作用以及免疫细胞释放炎性因子介导组织免疫损伤，从而产生的不良反应仍需要被重视[34]。

骨髓细胞通过表达信号调节蛋白-α(SIRP-α)来促进耐药性，SIRP-α是一种抑制性膜受体，CD47与巨噬细胞表达的SIRP-α结合抑制肿瘤微环境中的巨噬细胞吞噬作用[35]。抑制 CD47-SIRP-α信号通路也可促进适应性免疫反应并增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用[36]。由于CD47的非特异性产生的杀伤广覆盖性，目前CD47抑制剂多为低亲和力CD47和高亲和力肿瘤抗原组成的双特异性抗体。GPC3/CD47 抗体是偶联HCC相关GPC3抗原的靶点抑制剂。体外试验证实其增强了HCC细胞的ADCC效应，发现GPC3/CD47抗体优先针对表达双抗原的肿瘤细胞发挥强大的抗肿瘤活性[37]。HHLA2可以抑制细胞毒性CD8 T细胞及辅助性CD4 T细胞的增殖，KIR3DL3是HHLA2的抑制性受体，其通路活化可介导免疫抑制途径。有研究认为HHLA2表达与透明细胞肾细胞癌中的PD-L1表达不重叠，这表明HHLA2介导了一种独立于PD-L1的肿瘤免疫逃避机制[38]。HHLA2抑制剂可能是逆转肿瘤免疫逃避的更有效方法。遗憾的是，目前尚未有靶向CD47的药品上市，且关于HHLA2的研究仍处于基础实验阶段。

5 治疗性肿瘤疫苗及溶瘤病毒疗法

多肽疫苗利用肿瘤抗原肽诱导机体产生相应抗肿瘤免疫反应,以达到清除或控制肿瘤的目的。肿瘤特异性抗原多肽疫苗、癌基因和突变的抑癌基因多肽疫苗是常见的抗肿瘤相关多肽疫苗。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)突变导致细胞增殖和细胞凋亡失去平衡，其作为肿瘤抗原将是HCC免疫治疗的理想靶点，国外有Ⅰ期试验报道：GPC3肽疫苗对晚期HCC患者的疗效是通过诱导GPC3肽CTL浸润到肿瘤中，从而发挥抗肿瘤效应[39]。NK细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)是癌症结局的免疫遗传决定因素。特别是，KIR2DS2与对几种癌症的保护性反应以及对体外癌症靶标的直接识别有关。动物实验表明，新型的KIR2DS2-targeting治疗肽：MHC DNA疫苗可以激活NK细胞并因此产生功能性抗肿瘤效应[40]。核酸疫苗可通过特定途径激活机体免疫机制，在一款名为RO7198457的RNA疫苗的临床试验显示，晚期实体瘤的单药治疗达到4%的ORR(1/26)和40%的SD(9/26)，联合治疗ORR为8%(9/108)，SD为49%(53/108)[41]。

溶瘤病毒除直接裂解作用外，还可以通过释放肿瘤抗原以及编码和传递免疫刺激分子来间接启动和驱动全身抗肿瘤免疫[42]。Pexa-Vec(JX-594)，全称为Pexastimogene Devacirepvec，是一种基因改造后的溶瘤病毒，治疗试验过程中Pexa-Vec联合索拉非尼效果好于单独用药组，但是中期分析结果表明其延长患者生存期的可能性不高，因此溶瘤牛痘病毒Pexa-Vec，临床III期试验提前终止[43]。但从总有效率(ORR) 的角度评估Pexa-Vec联合纳武单抗在晚期HCC患者中的抗肿瘤活性和疗效的临床试验已经在后续开始[44]。综合而言，治疗性肿瘤疫苗及溶瘤病毒等方法处于临床前或临床早期阶段，仍需进一步完善，但其辅助抗HCC治疗的前景仍被看好。

6 结语

随着基础免疫学、现代分子生物学、细胞学的兴起，基因工程技术和合成生物学的不断推陈出新，新有效治疗靶点的不断发现。晚期肝细胞癌的治疗亦是不断涌现新的成果，从靶向治疗到现在的多种免疫治疗。但免疫治疗措施中，其未投入临床的研究成果仍处在探索阶段，已经面向临床的治疗仍需要在治疗方案的优化、不良反应的监测进一步努力。而且由于肝脏“免疫耐受”的复杂性 特点及HCC的异质性，如何开发出符合HCC疾病特点的免疫疗法仍然需要进一步探索。