大花卷丹繁殖方法及脱毒技术的研究

于新海 李濛 周红昕

(吉林省生物研究所，吉林 长春 130000)

百合(Lilium brownii var.viridulum Baker)又名番韭、山丹、倒仙等，是百合科百合属(Lilium)多年生草本球根类植物，目前全球共发现120个种，我国有55个种，36个特有种。长白山区的百合种源数较少，有9个种，2个变种[1]。由于特殊的地理位置和气候条件，长白山区的野生百合无论从株型花色、生长条件和营养成分含量上都具有不可替代的作用。百合属药食同源植物，在润肺止咳、清心安神，补中益气等方面有着显著功效[2]，尤其是大花卷丹，近年来在吉林省广泛种植，成为吉林省部分地区带动农户致富的经济作物，对吉林省特色经济提升具有十分重要的推动意义。

吉林省长白山区野生百合的开发和利用处于起步期，对长白山区野生百合的引种种植没有形成规模化，在食用百合种植方面，全省种植面积在50hm2左右，分布在蛟河、靖宇、伊通和通化。散户种植数量几乎没有，多以小规模个体农场、小型农业公司在种植。其原因归结于2方面，对长白山区野生百合品种的应用方向了解不够，不能准确定位长白山野生百合品种的市场前景和应用方向；长白山区野生百合的数量有限，人工栽培需要大量种球或种苗，因未解决种球繁殖培育技术，限制了长白山区野生百合的种植推广。

同时，由于森林锐减、湿地开垦、随意采挖、铁路公路建设、开矿及周边环境污染、放牧及野生动物啃食鳞茎、人工造林(包括外来树种、物种引入)等，有些长白山野生百合品种已经成为濒危品种，如垂花百合已被列入国家二级保护品种(第2批)。所以，仅依靠野生百合种源已经无法支撑吉林省百合种植产业的需求[3]。

因此，对大花卷丹繁殖技术的研究，不仅可以为企业提供成熟优质、无毒种球的培育方法，避免在种植过程中面临无种可种的“卡脖子”问题在吉林省发生，还可以有效推动吉林省百合产业的大发展和野生百合资源保护、开发及利用。

1 大花卷丹的传统繁殖方法

大花卷丹的传统繁殖方式主要有无性繁殖和有性繁殖2种，主要以种球移栽、鳞片扦插以及种子播种等方式进行培育[4]。

1.1 有性繁殖

为了增加大花卷丹的产量，在种植过程中通常采取去花处理，但为了保证大花卷丹的优良性状和种植的观赏性，在提纯复壮过程中会留一部分进行留花留种，这样在花期后形成的蒴果中可以得到大量种子，在北方的9月10—20日种子成熟后便可以采收。

采收后的蒴果去壳后晾干储存，千粒重约3.7g。入冬后，将采收后的种子用80%含量的多菌灵可湿性粉剂稀释800倍液后浸泡20min，再入清水浸泡20min，与3倍体积清洗后的细河沙混匀后分包入冷库沙藏，储藏条件为温度-5～-1℃，湿度为70%～80%。第2年5月进行旋耕整地做畦，标准为畦面宽120cm，作业道60cm，在畦面上进行播种，均匀播撒约500粒·m-2种子，覆盖细土3～5cm，用薄草帘覆盖并喷水保湿。10～15d便可出苗，出苗后去除草帘，进行田间管理，2a后便可进行种球收获移栽[5]。

1.2 无性繁殖

1.2.1 鳞片的扦插

北方地区，大花卷丹在9月10—20日地上部分已经返黄干枯，这时对大花卷丹进行采收，采收后的商品鳞茎通常会进行去除外层鳞片，抽真空塑封后进行销售。在去除的外层鳞片中，筛选出无病斑、无腐烂的正常鳞片作为扦插鳞片。不仅充分利用剥离的外层鳞片，避免浪费，而且有利于扦插鳞片的出苗和生根后的幼苗生长。

将筛选出的外围鳞片用80%含量的多菌灵可湿性粉剂稀释800倍液后浸泡20min，入清水浸泡5min，取出后晾干表面水分备用。另选扦插用地，避免重茬，进行旋耕整地做畦，标准为畦面宽120cm，作业道60cm，在畦面做行距10cm、深5cm的垄沟，将准备好的鳞片，基部沾取溶解后的生根粉溶剂，凹面向上斜插入垄沟内，覆盖细土后，用薄草帘覆盖保湿，此时秋季温度在20℃左右，鳞片在土壤中萌发，生根，但不会出苗，进入冬季后休眠，第2年春季出苗后去除草帘，进行田间管理。秋季进行收获种球分级移栽[6]。

1.2.2 种球分级移栽

近几年，大花卷丹在东北地区的种植面积不断扩大，根据大花卷丹的生长特性，每株大花卷丹地下根茎横走并生长出多个鳞茎，通过对繁殖的小鳞茎即种球的分级移栽，可有效控制移栽的种植密度，避免大小种球混栽出现株距不足、长势不一致而导致管理不便、养分不足、土地浪费等现象[7]。通过对种球品质的筛选，有利于种植过程中病害的防治及种源的提纯复壮[8]。

秋季对大花卷丹进行收获时，根据鳞茎的大小将收获的种球分为商品球、一级种球(20～30g)、二级种球(15～20g)和三级种球(15g以下)。分级后的种球，用80%含量的多菌灵可湿性粉剂稀释800倍液后浸泡20min，晾干表面水分。另选种植用地，避免重茬，进行旋耕整地做畦，标准为畦面宽120cm，作业道60cm，一级种球株行距15cm×15cm，二级种球株行距10cm×10cm，三级种球选择播撒的方式，以250kg·667m-2的标准均匀播撒在畦面上，覆盖细土7～10cm即可。定植后用玉米秸秆碎屑或者松针覆盖，浇透水，第2年出苗后进行田间管理[9]。

2 大花卷丹的组织培养及脱毒

在百合种植过程中，由于多年轮作，对种源质量把控不严，出现种源严重退化现象，现已检测出吉林省百合多携带黄瓜花叶病毒(CMV)，对百合的产量造成了严重的损失，成为限制吉林省百合大规模种植的关键因素之一。百合斑驳病毒(LMoV)、黄瓜花叶病毒(CMV)与百合无症病毒(LSV)是最易感染百合、危害最大的3种病毒[10]。其中，黄瓜花叶病毒会造成叶萎缩黄化、变皱、茎变形等病症[11]。然而，上述3种病毒常伴随出现，导致百合花叶斑驳、花叶变形、植株矮化或无主杆、百合切花或鳞茎品质不合格[12]，在种植生产上，百合的繁殖方式主要靠无性繁殖技术——扦插、分球等，这种方式会使感染百合的病毒不断传代，在开放环境下扩散感染其他植株，扩大病毒传播范围，对百合种植业造成严重的经济损失[13]。因此，百合脱毒苗制备技术对切断病毒传播、减少经济损失至关重要。

2.1 大花卷丹的组织培养

大花卷丹经过多代的种植常伴有种源退化和病毒积累等现象，所以目前通过组织培养技术对大花卷丹进行快速繁殖，既可以满足吉林省在大花卷丹种植生产上对种源的迫切需要，又能在组织培养的基础上对侵染病毒的植株进行脱毒[14]。成海钟等研究发现，在培养基中添加0.1mg·L-16-BA或KT可显著提高百合继代培养中芽的增殖效果，6-BA的效果优于KT的效果[15]；石印等研究发现，大花卷丹组织培养启动阶段添加6-BA和NAA可获得较好的不定芽诱导率，其中，细胞分裂素6-BA对大花卷丹的促进效果较明显[16]。

2.1.1 外植体诱导

通过实验得知，大花卷丹的不定芽诱导率、增殖倍数与所取鳞茎部位有密切关系。最佳取材部位为大花卷丹的中层鳞片，用洗衣粉水将鳞片冲洗干净后，流水冲洗60min，将外植体置于超净工作台中，75%酒精消毒90s，去离子水漂洗3遍，0.1%升汞处理30min，去离子水漂洗3遍，无菌滤纸吸干表面水分，将鳞片纵向切成长条鳞片(宽0.5～0.7cm)作为外植体接种于MS加NAA 0.1mg·L-1加6-BA 2mg·L-1诱导培养基上，每瓶接种3～4块切好的鳞片，在培养间内观察并及时去除染菌培养瓶。培养间条件：温度23～25℃，光照13～15h·d-1,光强为1500～2000lx。培养周期为25d，此时诱导率达75.7%。

2.1.2 不定芽增殖培养

诱导后的丛生芽长度在2cm以上时，分切转入增殖培养基内培养，增殖培养基：MS加NAA 0.2mg·L-1加6-BA 3mg·L-1加GA31mg·L-1，培养周期为22～25d，此时增殖系数达3.56。

2.1.3 小鳞茎诱导培养

经过增殖培养后将丛生芽分成单株，转入小鳞茎诱导培养基内培养。小鳞茎培养基：MS加NAA 1.0mg·L-1。23d左右膨大，形成小鳞茎后进行生根培养，此时也有部分鳞茎有生根现象。

2.1.4 小鳞茎生根培养

经过小鳞茎诱导后，小鳞茎开始膨大，将较大肥厚籽球至少有5个鳞片的小鳞茎转入生根培养基中培养。生根培养基：MS加IAA 0.2mg·L-1。培养10d后小鳞茎开始生根，在20d后基本完成生根，此时生根率可以达97.3%，平均每颗小鳞茎生根数可达9.2条。

2.1.5 组培苗出瓶移栽

根据茎叶及根的生长状况可以进行炼苗出瓶。选择根长在1cm以上，茎叶多的组培瓶进行开瓶炼苗，移栽至含有基质的穴盘内。扣棚保温保湿，在8d左右开始萌发新叶，出瓶苗成活率达96.7%。

2.2 大花卷丹的脱毒

近年来，百合常用的脱毒方法有茎尖培养、珠芽培养、热处理、化学药剂处理等，通常根据百合植株所携带病毒的种类采用不同的方法或者多种方法相结合对带病植株进行脱毒和二次脱毒，达到获得无毒种苗的目的[17]。本次脱毒实验是以吉林省目前已检测出携带黄瓜花叶病毒(CMV)的大花卷丹鳞茎为试材，采取热处理和茎尖培养相结合的方法进行脱毒，运用RT-PCR方法检测病毒，获得无毒植株并进行扩繁。

通过组培的方法获得携带黄瓜花叶病毒(CMV)的大花卷丹生根组培苗，将组培苗放入光照培养箱内培养，温度设置为40℃，其它培养条件与培养室条件相同。进行热处理3d后，在超净工作台内利用解剖镜剥取0.5mm左右茎尖并接种在MS加NAA 1.0mg·L-1培养基上培养。扩繁培养单个茎尖所产生的组培苗并做好分类标记，运用RT-PCR方法对各组组培苗检测黄瓜花叶病毒(CMV)，淘汰带毒组，将成功脱毒的大花卷丹进行组培扩繁，获得无毒植株。

3 小结与讨论

近年来，吉林省百合产业正蓬勃发展，无论是观赏、食用还是药用百合种植面积正在逐年扩大，尤其是大花卷丹，企业与种植户为了最快获取经济效益，只采用移栽种球的方法进行种植，目前在种植方面已出现大面积黄苗、减产、种源退化现象。为了避免大花卷丹在种植过程中出现种源不足或无种可种的情况在吉林省发生，通过探究大花卷丹的多种繁殖方式，合理规划种植区域，做好大花卷丹优质种源的培育工作，是企业和种植户持续获益的前提，是吉林省百合产业大发展的基础保障。