植物增殖细胞核抗原与DNA复制关系的研究现状

刘昕彤，王 希

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨 150080；2黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江省甜菜工程技术研究中心，哈尔滨 150080；3国家糖料改良中心/中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)研究人员在系统红斑狼疮患者的血清中发现的，早期被认定为自身免疫蛋白，后来发现PCNA只在正常的增殖细胞核中存在，所以被命名为增殖细胞核抗原[1]。PCNA仅在分裂的细胞中活跃，并且是以较高的浓度存在。PCNA 是一种分子量为36 kDa 的蛋白[2]。作为DNA 聚合酶δ 辅助蛋白的PCNA，合成在细胞核中，并且在细胞核中独立存在。PCNA 通过调节聚合酶与模板链的结合状态从而影响DNA 的合成。此外，它还参与细胞周期控制、错配修复、冈崎片段成熟、核苷酸切除修复、切除修复、核苷酸切除修复、姐妹染色单体重组、染色质组装、染色质重塑、跨损伤合成等[3]。

在过去的40年中，研究者对PCNA的研究从未停止，PCNA 的功能也越来越明确。PCNA 是一种无所不在的核蛋白，在DNA 的复制和修复中起重要作用。PCNA 是一种进化保守的环状核同型三聚体蛋白，属于DNA 滑动钳家族[4]。研究者们在植物、动物和微生物中均发现了PCNA 的存在，其中在对哺乳动物的PCNA的研究中发现，PCNA可以促进损伤旁路修复；在对植物的研究中发现，PCNA 参与DNA 的复制，可以提高相关蛋白的稳定性、并且可以促进相关的招募和动态交换。但是，有关PCNA 的研究还是以医学研究为主，研究对象也多为哺乳动物，植物PCNA的研究报道很少且研究较为落后。本研究将对PCNA的表达调控、PCNA 参与DNA 的复制、PCNA 参与DNA 的修复以及PCNA参与细胞周期调控这4个方面的功能研究现状进行归纳总结，希望为今后继续对PCNA 进行植物相关深入研究提供相关资料。

1 PCNA的结构

在生理状态下，PCNA 的存在形式是同源三聚体[5]，每个PCNA 单体均含有两个结构域，这2 个结构域的空间结构都是一致的，并且每个结构域的中心存在2 个α 螺旋，因此，每一个独立的PCNA 分子是由3个首尾相互连接的同源单体共同组成的一个形状特殊的闭合的六角形，所以可以推出一个PCNA 分子是由6 个一模一样的结构域和12 个α 螺旋组成。在PCNA参与DNA复制过程中，正因为这些α螺旋的存在才可以让PCNA附着在DNA双螺旋结构上，同时又可以在DNA 链上自由移动。除此之外，PCNA 还含有9 个反向平行的β折叠，这些β折叠作用在多种蛋白上，同时可以促进疏水作用。有研究发现PCNA 具有保守性，因此即使是进化水平存在差异的物种，它们的PCNA二级结构都是相同的，并且他们都有极为近似的三级结构[6]。同时经过研究可以发现PCNA 的复制模式以及它独特的三级结构满足DNA复制过程的需要，正因如此才使得它没有被淘汰。

PCNA是保守的滑动钳(sliding clamp)家族的成员之一，在古细菌和真核生物的基因组中均发现了PCNA 的存在[7]。研究发现每个拟南芥中均含有两个PCNA分子，这两个PCNA分子中的9个氨基酸各有不同，其氨基酸序列的一致性达到97%[8]。PCNA三聚体分子表面是由反向平行的β-折叠组成，分子中心是α-螺旋富含疏水残基，主要依靠氢键、离子键和β折叠而相互作用，这就意味着在表面存在着具有双重功能电子对，它不仅稳定了三聚体的分子结构，也解决了蛋白肽链之间首尾相接的结构。在PCNA三聚体分子的内表面含有带正电的赖氨酸和精氨酸残基，这些氨基酸残基被假设通过水的介导与DNA 链上的磷酸分子相互作用并在DNA单链上滑动[9-10]。环状的PCNA三聚体有同源和异源两种形式，且所有的复合物有着明显相似的结构。在拟南芥双分子荧光互补和生化试验表明，PCNA 蛋白单体可以结合形成4 种环状结构：1/1/1、1/1/2、1/2/2 和2/2/2[11]与PCNA 相互作用的蛋白质。目前在对PCNA分子层面的研究中其基因序列也在不同的物种中出现有关报道，其中在绝大部分高等植物中至少有两个PCNA 蛋白质，即PCNA1和PCNA2，目前，已在水稻、大豆、玉米、拟南芥、烟草等植物中发现了PCNA。大豆、水稻等植物的基因组至少编1 个PCNA，而玉米、拟南芥、烟草等的基因组编码至少2个PCNA。

2 PCNA的功能

2.1 PCNA参与DNA复制与修复

DNA复制是最基本的细胞过程之一，它确保生物体的遗传信息准确复制，并在细胞分裂期间传递给子细胞。在重要的生物学过程中，DNA复制是对参与该过程的蛋白质数量要求最高的过程。Replisome 是由200 多种多肽组成的复杂而动态的细胞机制[12]。PCNA在实现复制聚合酶复合物的过程性中起着不可或缺的作用，对细胞的生存至关重要[13]。PCNA 作为真核细胞DNA聚合酶的辅助蛋白，与不同的复制相关蛋白结合，协调DNA复制的过程[14]。近些年来在酵母和人类中，DNA聚合酶Polδ与PCNA的物理和功能相互作用已被广泛研究[15-16]。ScPolδ 由Pol3、Pol31 和Pol32亚基组成，而哺乳动物的Pol由p125作为催化亚基，p50、p68和p12作为结构亚基[17]组成。而在2000年左右就有学者发现了植物PCNA与Fen1的互作现象，并且在对其进行进一步探索后发现植物不仅可以与PCNA相结合，还可以增强Fen1的活性[18-20]。因此，目前在总结相关结论后研究人员发现，PCNA参与DNA复制，并且在复制过程中，可以提高复制中相关蛋白的稳定性，促进招募以及推进相关动态交换。由于PCNA 和复制因子C(replication Factor C，RFC)都是与DNA 复制和修复过程相关的蛋白[21]，在RFC 的帮助下，PCNA 不仅能在双链DNA 上自发滑动[22]，还能环绕双链DNA。一旦与DNA 结合，该复合物就成为一个结合平台，用于招募和协调与DNA代谢途径相关的多种调控DNA 复制和DNA 修复蛋白[23-24]。在植物体中，拟南芥RFC2/3/4/5 和水稻RFC1/2 的c 端是与PCNA 结合所必需的，而水稻RFC3/4/5 介导PCNA 相互作用的区域同时分布在N-和C端[25]。

Translesion DNA synthesis(TLS)通过对模板DNA的损伤修饰实现DNA 复制，并需要Rad6/Rad18 复合物对增殖细胞核抗原(PCNA)滑动钳进行单倍化。这种翻译后修饰对暴露于DNA 损伤剂后的细胞存活至关重要，并受到严格调控，以限制TLS 对受损DNA 的影响[26]。复制蛋白A(Replication protein A,RPA)是主要的单链DNA(ssDNA)结合蛋白复合物，在暴露于TLS 位点的ssDNA 上形成细丝，并在调控PCNA 单泛素化中发挥着关键的作用[27-28]。PCNA 参与TLS 的调节途径，它通过募集特殊的聚合酶来调控聚合酶与polε 和polδ 之间的相互作用，并且作为调节因子，PCNA提高了损伤旁路活性。而在拟南芥中目前只能得知其含有PCNA1 和PCNA2 两种不同的PCNA 亚型，同时通过进一步的研究发现与TLS相关的polη不能与PCNA1结合，只能与PCNA2结合[29]，但是却在后续没能发现PCNA是否可以提高拟南芥损伤旁路活性的相关报道。

植物体细胞中的DNA 分子在其生长发育过程中会受到来自外界的诸多因素的影响，例如物理因素和化学因素等，这些因素是造成DNA结构受损的主要原因之一，严重影响植物细胞的正常生长发育。在对DNA 进行修复时，发现了PCNA 的存在，并且PCNA还在该过程发挥着至关重要的作用[30]，它能够及时识别受损部位并对患处进行切除，再与修复蛋白相结合，并将其引到患处，从而修复受损伤的DNA。

DNA 损伤修复主要包括碱基剪切修复(Base Excision Repair，BER)、核苷酸剪切修复(Nucleotide Excision Repair，NER)、错配修复(Mismatch Repair，MMR)、同源重组(Homologous Recombination，HR)和非同源末端连接(Non-homologous End Joining，NHEJ)[31-32]。其中具体修复过程如下。

BER：碱基剪切修复，它是在DNA 序列的单个碱基出现错误时采用的修复方法。它的整个修复过程是通过DNA糖基化酶创造出AP位点，再由该AP位点的核酸内切酶切除磷酸骨架，之后利用PCNA 介导的DNA 聚合酶δ/ε 修复通路最后修复切口，完成整个修复过程。PCNA在这个过程中与AP内切酶APn、尿嘧啶DNA 糖基酶等均有结合并发挥着一定的作用，在BER修复中PCNA参与剪切与再合成这两个重要的步骤[33]。以上PCNA参与BER过程未能在植物体中找到相关报道。

NER：核苷酸剪切修复，它是在DNA 出现极为严重的损伤时采用的修复方式。它的修复过程分为全基因组修复和转录耦合修复两种，这两种修复通路最本质的差别在于二者的识别机制存在差异。最初人们主要在酵母和哺乳动物的DNA中研究切除修复机制，但随着近些年来对该研究的不断深入，切除修复机制在大部分相关酶类和植物体中也陆续被发现并得到相关验证，其中在参与核苷酸切除修复的多种相关蛋白中发现真核生物的切除修复是十分类似的，并且也发现了PCNA参与了植物体内的切除修复并在该修复中发挥着一定的作用。

很遗憾的是在查阅相关文献后发现在植物中对MMR 相关记载非常少，但目前已知的是在拟南芥中发现了错配修复的存在，并且克隆出了错配修复所必需的MSH2、MSH3、MSH6、MSH7等基因，这一发现证实了植物体内的错配修复过程与在哺乳动物和酵母体内的修复过程是十分相似的，并且确定了PCNA 在错配修复中的重要地位。这些年有关PCNA 参与DNA复制及修复的相关报道多集中在医学上对癌症、肿瘤及免疫系统相关的研究中，目前只能知道在植物体中，PCNA 的确可以通过参与DNA 复制及修复来提高相关蛋白的稳定性，并且相关研究多集中在拟南芥中，但未查到后续报道。

2.2 PCNA的表达调控

PCNA 几乎存在于植物的所有组织中,并且可以肯定的是PCNA 也在这些植物中均有表达，同时有趣的是，在一些细胞增殖发达的组织中PCNA 的表达量要比在成熟组织和一些非分化细胞的表达量高一些，例如PCNA 在玉米的根尖、芽中的表达量要比在成熟的叶、穗中的表达量高一些；水稻根尖PCNA的表达量要高于成熟水稻叶片中的表达量；在红花菜豆的萌芽期中PCNA的表达量比较高，而过了萌芽期后，它的表达量就会明显下降[34,18]。

影响PCNA表达调控的因素已有若干报道。水稻PCNA 启动子含有蛋白结合位点11a 和11b，这两个位点是利用操控PCF1 和PCF2 两种蛋白，进而影响着PCNA组织特异性的表达[35]，同时E2F也影响着PCNA的表达；在烟草中，烟草PCNA启动子上的E2F同样参与并调控PCNA 启动子区两个不同的结合位点，通过调节这两个不同的位点，使PCNA 在成熟组织和幼嫩组织中的表达出现差异，并且二者的表达量也不相同[36]。在经过一系列研究后发现，PCNA 的启动子上存在着两种顺式调节元件，即：site II motif 和telobox，正因为这两种不同的调节元件，使得PCNA 在不同阶段的表达量出现差异，这也说明细胞周期是影响PCNA基因表达的重要因素之一[37]。探究者在研究拟南芥时发现，拟南芥种子在萌发阶段所产生的脱落酸(ABA)也是调控PCNA 表达的因素之一，ABA 参与PCNA1 基因的表达，并且通过抑制着PCNA1 的表达量，进而影响着拟南芥种子的萌发[38]。崔看[39]选取拟南芥，通过RNAi 干涉和超表达试验筛选获得了PCNA1、PCNA2-OE纯合子植株及RFC4-OE植株，并以这些为材料，研究了基因突变对植株生长发育及其抵抗不同浓度DNA 复制毒性物质甲基磺酸甲酯(MMS)的影响，探究了RFC4基因及其互作因子PCNA对拟南芥生长发育的调控作用，解析了RFC4基因及其互作因子PCNA 对拟南芥生长发育的调控作用，这一研究对进一步揭示RFC 与PCNA 在植物中的互作关系及丰富植物基因组学有重要意义。PCNA在植物体内的表达受生长发育的调控这一观点现已被证实多年，但很遗憾的是，目前有关这方面的记载最近也只能追溯到2015年，未能找到后续相关报道。

除表达调控外，有报道称PCNA 在翻译水平上也受到调控。这些报道大多集中在酵母细胞和哺乳动物的PCNA 中，报道称PCNA 泛素化和SUMO 化参与调节PCNA，并且可以调控蛋白的相关功能[7,40-43]。PCNA泛素化包括PCNA单泛素化和PCNA多泛素化。其中PCNA 单泛素化通过影响跨损伤合成，从而修复损伤旁路；而PCNA 多泛素化则是利用未受损姐妹单体作为模板参与并调控损伤回避通路，从而影响着PCNA蛋白的相关功能。除此之外，酵母细胞中的PCNA 蛋白利用在Lys164 位点的SUMO 化推进PCNA 的招募以及影响Srs2 解旋酶的活性，同时还抑制了RadI5-ssDNA 的形成，一定程度上避免错误的同源重组。Lysl27位点SUMO化可以抑制PCNA结合特定蛋白如Ecol，从而抑制姐妹染色单体的凝聚。以上相关研究未能在植物体中找到相关报道，但在已有的拟南芥相关文献中发现，植物细胞和大肠杆菌中均发现了拟南芥两种PCNA（PCNA1和PCNA2）的存在，且均发现了SUMO 化的存在[44]；与此同时发现，UBC 可以修饰被泛素化的拟南芥PCNA[45]。但是目前SUMO化和泛素化修饰对植物PCNA 的生物学功能尚不明确，有待进一步研究。根据研究显示，人类滑动钳增殖细胞核抗原(hPCNA)，通过一个保守的结合基序PIP-box与超过200 个蛋白质相互作用，以协调DNA 复制和修复[46]。根据相关结论发现，PCNA 可以在细胞信号传导中起到支撑作用并且PCNA可以独立存在于染色质中。而细胞溶质PCNA 则通过结合procaspase 从而调节抑制中性粒细胞的活性，进而阻止细胞凋亡[47]。在神经母细胞瘤中，由于一氧化氮造成的应激反映，导致PCNA出现S-亚硝基化，进一步使caspase-9与PCNA的相互作用减少[48]。癌细胞表面的PCNA可以抑制自然杀伤细胞的细胞毒性功能，这一发现也被称作是癌细胞逃避抗肿瘤免疫的机制[49]。而参与信号转导的蛋白质在PCNA 复合物中被鉴定[50]。但未能找到有关植物PCNA相关免疫机制的报道。

2.3 PCNA参与细胞周期调控

对人体细胞中的PCNA 研究发现，PCNA 蛋白会随着细胞周期变化而改变，在不同细胞周期中，PCNA的含量差距较大，PCNA 通过与几种真核细胞周期蛋白（如CDK 复合体）相互作用而参与细胞周期调控。细胞周期调节蛋白p21CIP1/WAF1（此处简称p21）是已知的最高亲和力的hPCNA 相互作用蛋白(PIP)，一旦与hPCNA 结合，就会关闭复制。因此，这就阻碍了细胞周期的进展，为健康的增殖提供了必要的检查点。p21需要hPCNA的高亲和力来完成这个角色，并在与hPCNA 的相互作用和复制叉的竞争中击败其他蛋白质[24]。在对动物细胞中的PCNA 进行研究后发现，动物细胞中PCNA可以将CDK2与其基质相连接，继而影响并提高CDK2 对RFC 等复制相关酶类的磷酸化。PCNA可以通过催化polα来加快酶复合体磷酸化的进程。p21 是一种细胞周期抑制因子，在一些基因组受损的细胞或衰老细胞中，p21的N-末端与CDKs相结合，C-末端与PCNA相结合，使相关酶类的活性降低，从而抑制细胞周期的表达[51]。有关植物p21 同源基因的相关文献不是很多，但目前的研究已经证实植物中的PCNA 蛋白能够结合到人体中的p21 蛋白上，拟南芥PCNA 可以与p21 蛋白合成的多肽结合，但植物中没有p21 蛋白[52]，这也表明了PCNA 蛋白是具有一定保守性的。此外，目前已在拟南芥中发现，PCNA1 和PCNA2 参与细胞周期调控，并且与细胞周期蛋白D 互作[53]。刘飞峰等[54]通过PCR 技术、荧光抗体标记等技术，发现小麦PCNA 在UV-B 胁迫条件下其蛋白质含量和表达水平均会有所变化、并且找到了在不同分裂时期下PCNA与染色体的关系。从而对进一步研究小麦“分束分裂”奠定了相关理论基础。但很遗憾的是，近几年有关PCNA 在植物上参与细胞周期调控方面未见后续报道。

3 展望

（1）根据迄今为止的报道，PCNA的结构已经基本可以确定，即，一个完整的PCNA分子是由3个首尾相连的同源PCNA单体共同构成的一个特殊的六边形封闭三级结构。PCNA不仅存在于动物、微生物中，在植物和病毒中也具有PCNA类似因子，例如在玉米、拟南芥、水稻和小麦等植物上均发现了PCNA的存在，并且其每个基因组都包含至少2个PCNA蛋白。

（2）PCNA与DNA聚合酶δ的相互作用确保DNA聚合酶δ 在复制过程中不会从DNA 链上滑落。每一次DNA链与聚合酶结合后合成的核苷数量越多，说明PCNA 的蛋白活性越高。崔看等[7]在对拟南芥的研究中已经证实了PCNA参与调控植物的生长发育。此外笔者还发现相较于成熟的植物组织（例如成熟的叶片），一些发育中的组织（例如根尖、芽）中的PCNA 表达量要更高一些，这也说明了PCNA的细胞增殖特性。

（3）关于PCNA 的研究一直以来是研究学者探讨的热点，PCNA 在细胞增殖过程中扮演着不可缺少的角色，在众多的调控通路中PCNA都起着重要的作用，调控通路不同，其调控的蛋白功能不同，此外PCNA还参与了染色体重组、细胞周期转化以及细胞衰亡等多种细胞生命活动过程。

（4）根据目前已有的文献基本可以证实，PCNA通过与聚合酶中不同的亚基相互作用，参与DNA复制体的形成，从而调控着DNA 的复制过程；PCNA 通过与多种修复相关蛋白相互作用，将蛋白引到受损部位，利用切除等方法对DNA受损部位进行修复，以确保植物体可以正常生长发育。

近些年来学者对植物中的PCNA 研究不断深入，并且已取得了非常不错的成果，但是不可否认的是，对PCNA的研究是从哺乳动物中开始的，并且，相较于植物中PCNA，在动物和酵母中对PCNA 的研究更深入一些。（1）PCNA的泛素化就是从哺乳动物和酵母细胞中的PCNA 中发现的，并且PCNA 的泛素化可以调控相关蛋白的功能，而在植物体中还无法确定泛素化对植物PCNA功能的影响。未来在研究植物PCNA功能时，可以考虑泛素化对其的影响；（2）DNA修复中的错配修复(MMR)也在植物中研究不足，现有的研究也只能说明在植物体中MMR的修复过程与在酵母细胞和哺乳动物中的修复过程极度相似，却也没有更深入的研究记载。希望在之后可以对植物体的MMR进行更深入的研究；（3）尽管近几年学者从未停止对PCNA的研究，但是却都集中在医学和动物体上，研究植物中的PCNA 也还停留在2015 年左右。因此，对PCNA 在植物中的研究还需不断深入，以弥补相关资料不足的遗憾。