高效液相色谱-串联质谱法测定带鱼中4种茶多酚的含量

王登飞,陈 泳,王瑞龙,陈练洪

(漳州海关综合技术服务中心，漳州 363005)

带鱼富含蛋白质、脂肪，是中国老百姓常吃的海水鱼之一。带鱼极易腐败，且有很强的季节性，如何有效保鲜和延长其货架期，一直是研究人员关注的热点。随着生活品质的提高，传统的化学保鲜方法已不能满足人们对食品安全的要求。茶多酚作为一种天然无毒的生物保鲜剂，具有良好的抗菌、抗氧化性，已越来越多地应用于带鱼等水产品的保鲜领域中[1-8]。文献[9]发现，采用茶多酚溶液处理带鱼段可有效保持其感官品质和延长其保鲜货架期。文献[10]采用壳聚糖和茶多酚的复合物涂抹带鱼，能将带鱼的保鲜期从4～5 d 延长至12～13 d。GB 2760－2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定预制水产品(半成品)、熟制水产品(可直接食用)和水产品罐头中茶多酚的最大使用量为0.3 g·kg－1(以油脂中儿茶素计)。因此，带鱼中茶多酚含量的检测具有重要的应用价值。

茶多酚的检测方法主要有分光光度法[11-12]、电化学分析法[13]、色谱法[14-17]、色谱-质谱法[18-21]等。其中，液相色谱-串联质谱法具有良好的定性定量、抗干扰能力等特点，在茶多酚检测中应用较多[18，22]，但其研究对象多为茶叶、坚果炒货[23]、保健品[24]等，未见在带鱼等水产品中的应用。相关标准GB/T 8313－2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》和SN/T 3848－2014《出口食品中茶多酚的检测方法 高效液相色谱法》分别适用于茶及茶制品，食用油、糕点、方便米面、油炸食品及肉灌肠的检测，不涉及水产品中茶多酚的检测，这导致监管部门无法对水产品中茶多酚用量是否超标进行有效判定。

鉴于此，本工作采用高效液相色谱-串联质谱法测定带鱼中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表儿茶素(EC)等4种茶多酚的含量，以期为带鱼中茶多酚用量的监管提供方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪;API 4000型串联质谱仪，配Analyst质谱工作站;XW-80A 型涡旋混合器;Sigma 3K15 型离心机;BSA2202S 型电子天平;BS124S型电子天平;Milli Q 型超纯水器;BUCHI Syncore Analyst R-210 型旋转蒸发仪;MMV-100W 型分液漏斗振荡器。

单标准储备溶液:0.1 g·L－1，取适量EGCG、EGC、ECG、EC 标准品，用甲醇溶解和稀释，置于－20 ℃保存。

混合标 准中间 液:5.0 mg·L－1，取适量EGCG、EGC、ECG、EC 单标准储备溶液，用甲醇稀释，置于－20 ℃保存。

混合标准工作液系列:以空白带鱼样品溶液作稀释剂，将混合标准中间液稀释成10，20，40，100，200μg·L－1的混合标准工作液系列。

EGCG 标准品纯度为99.0%;EGC标准品纯度为99.2%;ECG 标准品纯度为98.6%;EC标准品纯度为96.7%。

甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲酸均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Waters Atlantis d C18色谱柱(150 mm ×2.1 mm，5μm);柱温30 ℃;流量0.3 mL·min－1;进样量10μL;流动相A 为乙腈，B为0.1%(体积分数，下同)甲酸溶液。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源，负离子(ESI－)模式;离子源温度500 ℃;电喷雾电压－4 500 V;碰撞气压力0.041 MPa，气帘气压力0.138 MPa，雾化气压力0.379 MPa，辅助气压力0.414 MPa;多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表2。

表2 质谱参数Tab.2 MS parameters

1.3 试验方法

将市售带鱼样品去头、骨和内脏后，取可食用部分，用料理机均质。取2 g(精确至0.01 g)样品，加入20 mL 乙酸乙酯，涡旋1 min，振荡30 min，以9 800 r·min－1转速离心5 min。将乙酸乙酯相转移至50 mL鸡心瓶中，减压旋蒸至近干，加入10%(体积分数，下同)乙腈溶液2 mL 溶解残渣，振摇后转移至10 mL容量瓶中，再用10%乙腈溶液2 mL重复洗涤一次。合并洗涤液于容量瓶中，用10%乙腈溶液稀释至刻度，摇匀。以12 000 r·min－1转速离心5 min，上清液过0.22μm 滤膜，滤液供优化的仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

空白带鱼样品和加标空白带鱼样品的色谱图见图1。

图1 空白带鱼样品和加标空白带鱼样品的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of the blank hairtail sample and the spiked blank hairtail sample

2.2 前处理条件的选择

茶多酚可溶于水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷等溶剂。试验考察了以上5种溶剂对4种茶多酚提取效果的影响。结果表明:以水作提取剂时，提取液中杂质太多且不易净化;以甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷作提取剂时，带鱼中4种茶多酚能被有效提取，但经乙腈(70.0%～84.9%)、正己烷(65.2%～80.3%)提取后 的回收 率不如甲醇(76.8%～91.5%)、乙酸乙酯(81.2%～92.0%)的。考虑到甲醇提取液中杂质较多，质谱干扰较大，试验选择乙酸乙酯作提取剂。

试验比较了减压旋蒸和氮吹两种去溶剂法对4种茶多酚回收率的影响。结果显示:减压旋蒸时间明显快于氮吹的，且回收率(81.2%～92.0%)好于氮吹的(71.1%～90.3%)。因此，试验选择用减压旋蒸的方法浓缩提取液，但不能浓缩至太干，否则会显著影响目标物的回收率。残渣采用10%乙腈溶液溶解，当溶解两次及以上时，目标物回收率较高且保持不变，故试验选择的溶解次数为两次。

2.3 流动相的选择

试验考察了分别以乙腈-水体系、甲醇-水体系、甲醇-0.1%甲酸溶液体系、甲醇-0.5%(体积分数，下同)甲酸溶液体系，乙腈-0.1%甲酸溶液体系、乙腈-0.5%甲酸溶液体系、乙腈-含10 mmol·L－1乙酸铵的0.1%甲酸溶液体系等作流动相时对4种茶多酚分离效果的影响。结果表明:以甲醇和乙腈作有机相时，4种茶多酚的分离效果和灵敏度没有明显差异，但甲醇与水混合时压力较大，部分采用聚醚醚酮(PEEK)管连接的管路易发生漏液现象;相比较水，以0.1%，0.5%甲酸溶液作水相时4种茶多酚的分离度更好，峰形更尖锐，而甲酸溶液体积分数对分离效果影响不大;对比乙腈-0.1%甲酸溶液体系和乙腈-含10 mmol·L－1乙酸铵的0.1%甲酸溶液体系作流动相时的分离效果，后者所得4种茶多酚的灵敏度明显下降，推测乙酸铵对茶多酚的离子化有抑制作用。综合考虑，试验选择的流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液体系。

2.4 质谱条件的选择

用体积比1∶1甲醇-0.1%甲酸溶液的混合溶液作稀释剂配制100μg·L－1混合标准溶液，用针泵连续进样，在ESI－模式下做Q1扫描，确定每种目标物的母离子，并优化母离子参数;通过子离子扫描，选择定量、定性离子，并优化子离子参数;在MRM 模式下对母离子、子离子的各项参数再次进行优化，使其达到最佳状态。连接串联质谱仪与高效液相色谱仪，不接色谱柱，采用流动注射分析(FIA)方式，对离子源参数进行优化，所得质谱参数见1.2.2节。

2.5 工作曲线和检出限

按照仪器工作条件测定混合标准工作液系列，以各目标物的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，所得工作曲线的线性范围为10～200μg·L－1，其他线性参数见表3。

表3 线性参数Tab.3 Linearity parameters

以不小于3，10倍信噪比对应的质量分数作检出限和测定下限，检出限均为0.03 mg·kg－1，测定下限均为0.10 mg·kg－1。

2.6 精密度和回收试验

按照试验方法对空白带鱼样品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平做6个平行样，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表4。

由表4可知，4种茶多酚的回收率为81.2%～92.0%，测定值的RSD 为2.9%～6.8%，符合检测需求。

表4 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 稳定性试验

按照试验方法制备样品溶液，分别放置0，4，8，12，16，24 h后进样，EGCG、EGC、ECG、EC 测定值分别为0.82，0.85，0.84，0.88 mg·kg－1，峰面 积RSD 分别为2.4%，1.7%，1.2%，2.1%，说明样品溶液在24 h内稳定性较好。

本工作采用高效液相色谱-串联质谱法测定带鱼中4种茶多酚的含量，方法简单，快速、准确度高、精密度好，适用于带鱼中4种茶多酚的确证和定量。