高效液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中9种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的含量

陈桂娟,邢海艳,刘 洋,苏 晶,姚欣悦

(1.江苏护理职业学院，淮安 223005;2.淮安市食品药品检验所，淮安 223005)

防腐剂是化妆品中的重要添加剂，可抑制微生物的生长，延长化妆品的使用期限。但是，化妆品中的防腐剂会导致皮肤过敏和接触性皮炎，直接影响化妆品的使用安全[1-3]。因此，国内外对防腐剂的使用种类和使用量有明确规定[4-5]。对羟基苯甲酸酯类防腐剂是化妆品中使用率占据前三的防腐剂之一[6]，其防腐机制是破坏微生物的细胞膜，使细胞内的蛋白质变性和抑制微生物细胞呼吸酶与电子传递酶的活性，从而起到抑菌作用，但有文献报道此类化合物有类似雌激素的作用[7-10]，且4-羟基苯甲酸异丙酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-羟基苯甲酸戊酯、4-羟基苯甲酸苯酯、4-羟基苯甲酸苄酯等5种化合物对皮肤刺激性较强，是禁用防腐剂。《化妆品安全技术规范》(2015年版)规定4-羟基苯甲酸甲酯和4-羟基苯甲酸乙酯的使用限量为0.14%(质量分数，均按4-羟基苯甲酸计，下同)，4-羟基苯甲酸丙酯和4-羟基苯甲酸丁酯的使用限量为0.4%，联合使用总限量为0.8%[1]。该规范虽然规定了51种可使用的防腐剂，但只收载了27种防腐剂的检测方法，不包含4-羟基苯甲酸戊酯、4-羟基苯甲酸苯酯、4-羟基苯甲酸苄酯等。相关文献较多，检测方法包括气相色谱-质谱法[11]、高分辨质谱法[12]、高效毛细管电泳法[13]、高效液相色谱-质谱联用法[14]和气相色谱-串联质谱法[15]，但研究的对羟基苯甲酸酯类防腐剂种类较少，尤其是4-羟基苯甲酸异丙酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-羟基苯甲酸戊酯、4-羟基苯甲酸苯酯、4-羟基苯甲酸苄酯等禁用防腐剂。文献[16]采用高效液相色谱法测定了化妆品中4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸异丙酯、4-羟基甲酸丁酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-羟基甲酸戊酯、4-羟基苯甲酸苯酯和4-羟基苯甲酸苄酯等9种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的含量，但该方法灵敏度较低、专属性较差，不能满足实际样品中痕量目标物的分析要求。鉴于此，本工作采用灵敏度更高、专属性更强的高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定了上述9 种目标物的含量，可为化妆品中相关化合物的质量监管提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

AB QTRAP 4500 型高效液相色谱-串联质谱仪，配Turbo-V 离子源、蠕动泵和Analyst 1.5.2数据处理系统;KQ-250DV 型超声清洗仪;Millipore型超纯水机;XP-6型电子天平;XS205DU 型电子天平;0.22μm 有机系针筒式微孔滤膜。

单标准储备溶液:100 mg·L－1，取适量对照品，用甲醇溶解并定容，摇匀。

混合标准中间液:1 mg·L－1，取各单标准储备溶液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。

混合标准溶液系列:取混合标准中间液0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2 mL，置 于10 mL容量瓶中，用甲醇 稀释成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0μg·L－1的混合标准溶液系列。

4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸异丙酯、4-羟基甲酸丁酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-羟基甲酸戊酯、4-羟基苯甲酸苯酯和4-羟基苯甲酸苄酯对照品的纯度分别为100%，99.9%，99.5%，99.6%，99.5%，99.0%，100%，100%，100%;乙腈、甲醇均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm);柱温30 ℃;进样量2μL。流动相A 为0.1%(体积分数，下同)甲酸溶液，B 为乙腈，按表1 程序进行梯度洗脱，流量0.3 mL·min－1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源，负离子(ESI－)模式;多反应监测(MRM)模式;碰撞气压力68.95 k Pa，气帘气压力206.85 k Pa，雾化气压力379.225 kPa，辅助气压力379.225 k Pa;毛细管电压4 500 V;雾化温度500 ℃。其他质谱参数见表2。

表2 质谱参数Tab.2 MS parameters

1.3 试验方法

取样品0.25 g，置于50 mL 具塞试管中，加入甲醇30 mL，超声提取30 min。放冷，用甲醇稀释至50 mL，用0.22μm 有机滤膜过滤，取续滤液，注入高效液相色谱-串联质谱仪，按照1.2节仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

参考《化妆品安全技术规范》(2015 年版)中4.12节内容，考察了分别以甲醇、50%(体积分数，下同)甲醇溶液、乙腈等作提取溶剂时9种目标物的回收率，结果见表3。

表3 不同溶剂提取时各目标物的回收率Tab.3 Recovery of each target extracted by different solvents

由表3可知，使用以上3种溶剂提取时各目标物的回收率均大于80.0%。综合考虑提取溶剂的毒性、极性、配制难易程度以及回收率等因素，试验选择甲醇作提取溶剂。

2.2 取样量的选择

试验比较了取样量分别为0.10，0.25，0.50 g时各目标物的回收率。结果显示，取样量对各目标物回收率的影响不大。综合考虑，试验选择的取样量为0.25 g。

100.0μg·L－1混合标准溶液的色谱图如图1所示。

图1 混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solution

2.3 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列，以各目标物的质量浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，9种目标物的线性范围均为0.5～200.0μg·L－1，其他线性参数见表4。

参考《中华人民共和国药典》(2015年版)，分别以信噪比(S/N)法和标准偏差与标准曲线斜率比(s/k)法计算检出限和测定下限。取样品约0.25 g，加入1 mg·L－1混合标准中间液5，25μL，按照试验方法测定，以3S/N 对应的质量浓度作为检出限，10S/N 对应的质量分数作为测定下限。按照仪器工作条件测定1.0μg·L－1混合标准溶液11次，分别以3s/k和10s/k计算检出限和测定下限，并根据取样量和定容体积换算成质量分数，结果见表4。

表4 线性参数、检出限和测定下限Tab.4 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

表4 (续)

为确保数据准确可靠，选取数值较高结果作为本方法的检出限和测定下限，即4-羟基苯甲酸戊酯选择s/k法的，其他8 种目标物均选择S/N 法的，所得9种化合物的检出限为0.015～0.092μg·g－1。

2.4 精密度和回收试验

取100.0μg·L－1混合标准溶液，连续进样6针，9种目标物测定值的相对标准偏差(RSD)分别为1.5%，1.9%，2.0%，2.4%，1.8%，1.9%，2.7%，1.3%，2.4%，说明仪器的稳定性较好。

按照试验方法对空白样品进行5个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平平行测定6次，计算回收率和测定值的RSD，结果见表5。

表5 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表5 可知，各目标物的回收率为88.6%～106%，测定值的RSD 为0.90%～11%，满足实际检测需要。

2.5 耐用性试验

更换不同品牌、不同型号的C18色谱柱[Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm)，赛默飞AcclaimTMTrinityTMP1 C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，3μm)，费罗门Kinetex®C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm)]，调整初始流动相比例(有机相体积分数为5%～20%)和柱温(25～40 ℃)，并分别使用AB QTRAP 4500型高效液相色谱-串联质谱仪与AB QQQ 4000＋型高效液相色谱-串联质谱仪检测，记录色谱图。结果显示，9种目标物均能达到良好分离，说明方法对色谱柱、流动相比例、柱温、仪器等要求较低，方法的耐用性很好。

2.6 样品分析

按照试验方法分析市售护肤水、精华露、护肤喷雾、护肤乳液(2批)、护肤霜、洗发水(2批)、护发乳、沐浴露、啫喱水、面膜、口红、隔离霜、宝宝霜等15批化妆品样品。结果显示:在隔离霜中检出了4-羟基苯甲酸甲酯，检出量为0.435μg·g－1;在1批洗发水中检出了4-羟基苯甲酸苄酯，检出量为0.110μg·g－1;在精华露中检出了4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯和4-羟基苯甲酸苄 酯，检出量 分别为18.1，2.89，1 364，0.125μg·g－1;在沐浴露中检出了4-羟基苯甲酸苄酯，检出量为0.104μg·g－1;在面膜和护肤霜中均检出了4-羟基苯甲酸甲酯和4-羟基苯甲酸丙酯，检出量为4.25，2.89μg·g－1和1 795，11.0μg·g－1。4-羟基苯甲酸苄酯的检出量较低，在测定下限附近，可能由化妆品原料残留引入。

本工作采用HPLC-MS/MS同时测定化妆品中9种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的含量，方法提取简便、分离效果好、检出限低、灵敏度高、专属性强、准确度高、分离效果好，可满足此类防腐剂的检测要求，为化妆品检测和监管提供了新的方法。