不同粒度猫尾草对羔羊体外发酵特性和微生物数量的影响

王静，孔令莹，徐建风，康静，沈振峰，刘婷

（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070）

猫尾草（Uraria crinita）为多年生禾本科牧草，因其叶量丰富、草质细嫩、适口性好，常作为赛马和兔子等观赏动物饲料的纤维来源［1］。奶牛采食猫尾草能增加逆呕次数，延长产奶期，提高生产性能和产奶量［2-3］。但以猫尾草作为幼龄反刍动物开食料纤维素来源的研究却鲜有报道。中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）是评价粗饲料营养价值的重要指标，其作用效果受到粒度、来源和水平等因素的影响［4-5］，其中，粗饲料粒度在促进瘤胃发酵和维持瘤胃内环境稳态过程中发挥着重要的作用［6-7］。前期研究发现，粗饲料物理形态和粒度影响断奶后幼龄反刍动物瘤胃发酵和微生物区系，但研究结果存在较大的差异［8］，这是不同粗饲料的物理和化学性质差异所致。基于此，探求猫尾草适宜粒度是利用其作为幼龄反刍动物开食料纤维素来源的关键问题。本试验在相同营养水平基础上，通过研究含有不同粒度猫尾草的全混合日粮（total mixed ration，TMR）对3 月龄羔羊体外瘤胃发酵参数和瘤胃微生物菌群数量的影响，以期为猫尾草在幼龄反刍动物开食料中的合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲粮

于2021年1 月，在甘肃农业大学动物科学实训教学中心开展试验。选择3 只健康且体重相近［（13.42±0.73）kg］的3 月龄瘘管羊作为瘤胃液供体动物，每天饲喂3 次，自由采食和饮水，保证羊舍卫生干净并定期消毒。猫尾草购自甘肃润牧生物工程有限责任公司，带回实验室测定初水分后，将其斩（碾）碎过筛，制备6 个不同粒度，分别为1.00、2.36、3.35、4.75、8.00 和12.50 mm。参照NRC［9］13 kg 绵羊羔羊饲养标准配制TMR 作为发酵底物（表1），其中猫尾草是试验饲料纤维素唯一来源。各处理组饲料除猫尾草粒度不同外，其他饲料原料粒度（0.425 mm）均保持一致。

表1 饲粮组成及营养成分Table 1 Dietary composition and nutrient composition（dry matter basis）

1.2 试验设计

采用单因素和双因素试验设计，按照猫尾草的粒度将试验分为6 个处理组，分别为1.00 mm 组、2.36 mm 组、3.35 mm 组、4.75 mm 组、8.00 mm 组和12.50 mm 组。应用Rusitec-s 人工瘤胃系统（Sanshin，东京，日本），将8 个发酵罐分为2 个处理，每个处理组4 个重复，每2 个处理组共同发酵48 h，在同等试验条件下共进行3 批，进行为期16 d 的试验，前10 d 为人工瘤胃系统稳定期，后6 d 为正试期。

1.3 人工瘤胃培养试验

1.3.1 瘤胃液采集 晨饲前利用采集器收集试验羊瘤胃液，经4 层细纱布过滤至已预热［（39±0.5）℃］处理过的保温桶内，在此过程中持续通入CO2以保证厌氧环境，然后立即密封。与此同时，收集固体食糜后进行保温处理，带回实验室置于（39±0.5）℃恒温水浴箱中进行分装。

1.3.2 体外发酵培养 按照Mc Dougall［11］的方法配制人工瘤胃缓冲液。并在试验开始前置于水槽内预热至（39±0.5）℃，与瘤胃液按1∶1 分装至发酵罐，并将装有70 g 固体食糜的尼龙袋与10 g 样品一并投入发酵罐内。利用Rusitec-s 人工瘤胃系统，参照Kajikawa 等［12］的体外发酵方法进行48 h 的体外发酵。其中，缓冲液流量为0.39 mL·min-1，流出液口筛网孔径为1.2 mm，搅拌机搅拌频率为4～5 次·min-1，发酵罐内保持（39±0.5）℃和厌氧环境。

1.3.3 样品采集与测定 分别在体外发酵3、6、9、12、24 和48 h 时，使用酸度计（PHS-3C，雷磁仪器厂，上海，中国）测定每个罐中发酵液pH。48 h 发酵结束后，收集各罐中发酵液和发酵残渣用于测定发酵参数和瘤胃微生物菌群数量。采集发酵液5 mL 至液氮罐中，带回实验室后保存在-70 ℃冰箱，用于测定瘤胃微生物菌群的数量。另外，采集2 mL 发酵液，4 ℃、12000 r·min-1离 心10 min 取 上 清 液1 mL 于2 mL 离心管内，-20 ℃保存，用于发酵液挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）和 氨 态 氮（ammonia nitrogen，NH3-N）浓度的测定。参照冯宗慈等［13］的方法测定NH3-N 浓度。参照郑琛等［14］的方法使用气相色谱仪（6890N，Agilent，美国）测定VFA，色谱柱为HP 19091N-213 毛细管柱。色谱分析条件为：进样口温度220 ℃，N2流量2.0 mL·min-1，分流比40∶1，程序升温模式为120 ℃保持3 min，然后10 ℃·min-1升温至180 ℃，保持1 min，火焰氢离子检测器（flame ionization detector，FID）250 ℃，FID 空气、H2和N2流量分别为450、40 和45 mL·min-1［15］。

收集发酵残渣烘干后，分别按照Cunniff［16］和Van Soest 等［17］的方法测定干物质（dry matter，DM）、粗蛋白质（crude protein，CP）、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量，并计算发酵底物中各营养成分的体外降解率，计算公式如下：

1.4 微生物菌群数量的测定

参照Yuan 等［18］的方法提取发酵液微生物总DNA。使用超微量紫外分光光度计（NanoDropTMOne，美国）测定发酵液微生物总DNA 吸光度（OD），OD260/OD280均为1.8～2.0，可进行下一步分析。按照SYBRGreenⅡ预混试剂盒建议的20 μL 反应体系，使用实时定量PCR 对发酵内容物总菌（total bacteria，TB）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens，B.f）、产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes，F.s）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus，R.a）、总产甲烷菌（totalMethanogens，TMe）和甲烷杆菌（Methanobacteriaceae，Mba）进行测定。目的微生物的数量分别以16S rRNA 或18S rRNA 基因拷贝数（拷贝数·mL-1）表示，引物序列见表2。

表2 瘤胃微生物引物序列Table 2 Rumen microbial primer sequence

1.5 数据统计与分析

使用SPSS 21.0 软件对试验数据进行分析，48 h 养分降解率、发酵液参数和微生物绝对数量用单因素方差分析，发酵液动态pH 值用双因素方差分析，差异显著时采用Tukey 法进行多重比较，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同粒度猫尾草对体外营养物质降解率的影响

由表3 可知，体外干物质降解率（in vitrodry matter degradability，IVDMD）随着猫尾草粒度的增加而降低，其中4.75 和12.50 mm 组 显 著 低于1.00 mm 组（P＜0.05）；而 体 外 粗 蛋 白 质 降 解 率（in vitrocrude protein degradability，IVCPD）随着猫尾草粒度的增加而升高，其中，12.50 mm 组显著高于1.00、2.36 和3.35 mm 组（P＜0.05）；体外中性洗涤纤维降解率（in vitroneutral detergent fiber degradability，IVNDFD）随着猫尾草粒度的增加而逐渐降低，其中，1.00 和2.36 mm 组显著高于8.00 和12.50 mm 组（P＜0.05）。而体外酸性洗涤纤维降解率（in vitroacid detergent fiber degradability，IVADFD）在各处理组间差异不显著（P＞0.05）。

表3 不同粒度猫尾草48 h 体外发酵对养分降解率的影响Table 3 Effects of fermentation in vitro for 48 h on nutrient degradability of U.crinita with different particle sizes（%）

2.2 不同粒度猫尾草对体外发酵液参数的影响

由表4 可知，不同粒度猫尾草经48 h 体外发酵在6 个时间点的pH 值均无显著差异（P＞0.05），但都呈先降低后升高的趋势，且时间和粒度间无显著的交互作用（P＞0.05）。

表4 不同粒度猫尾草体外发酵动态pH 值Table 4 Dynamic pH value in vitro fermentation of U.crinita with different particle sizes

由表5 可知，NH3-N 浓度和总挥发性脂肪酸（total volatile fatty acid，TVFA）随着猫尾草粒度的增加呈先降低后升高的趋势，其中，12.50 mm 组显著高于3.35 和4.75 mm 组（P＜0.05）；丙酸摩尔比也随着猫尾草粒度的增加呈先降低后升高的趋势，其中，1.00 mm 组显著高于4.75 mm 组（P＜0.05）；而1.00 mm 组异丁酸和丁酸摩尔比显著低于8.00 和2.36 mm 组（P＜0.05），异戊酸和戊酸摩尔比显著低于2.36 mm 组（P＜0.05）；乙酸摩尔比和乙酸/丙酸在各处理组间无显著差异（P＞0.05）。

表5 不同粒度猫尾草对48 h 体外发酵液参数的影响Table 5 Effects of different particle sizes of U.crinita on parameters of fermentation broth in vitro for 48 h

2.3 不同粒度猫尾草对发酵液微生物绝对数量的影响

由表6 可知，随着猫尾草粒度的增加，B.f 和Mba 的数量呈先升高后降低再升高的趋势，其中，2.36 mm 组B.f显著高于3.35 和4.75 mm 组（P＜0.05），Mba 显著高于3.35、4.75 和8.00 mm 组（P＜0.05）。TMe 数量随着猫尾草粒度的增加先降低后增加，其中，4.75、8.00 和12.50 mm 组显著高于1.00 和2.36 mm 组（P＜0.05），TB、F.s 和R.a 在各处理组间无显著差异（P＞0.05）。

表6 不同粒度猫尾草对48 h 发酵液微生物绝对数量的影响Table 6 Effects of different particle sizes of U. crinita on the absolute number of microorganisms in fermentation broth for 48 h［log10（copies·mL-1）］

2.4 体外瘤胃发酵特征与微生物相关性分析

由表7 可知，TB 与NH3-N 和乙酸呈正相关（R2=0.84，P=0.038；R2=0.88，P=0.021）；B.f 与丙酸呈正相关（R2=0.82，P=0.045），与pH 呈 负 相 关（R2=-0.98，P=0.001）；TMe 与IVCPD 呈 正 相 关（R2=0.91，P=0.012），与IVDMD 和IVNDFD 呈负相关（R2=-0.86，P=0.027；R2=-0.83，P=0.043）；Mba 与pH 呈负相关（R2=-0.90，P=0.015）。

表7 瘤胃发酵特性与微生物相关性分析Table 7 Correlation analysis of rumen fermentation characteristics and microorganisms

3 讨论

3.1 不同粒度猫尾草对体外营养物质降解率的影响

瘤胃内干物质降解率是影响反刍动物对营养物质降解与发酵的重要因素［24］。本试验中，IVDMD 和IVNDFD 随着猫尾草粒度的增加而降低，与多项研究结果一致，如Zhao 等［25］研究发现，在装有瘤胃瘘管的肉牛日粮中含加工的大麦（Hordeum vulgare）籽粒粉碎比例越高，原位降解率越高；Ueda 等［26］发现，随着饲料颗粒尺寸的减小，会增加颗粒与瘤胃微生物的接触面积，结构型碳水化合物更容易被降解，从而提高瘤胃IVDMD 和IVNDFD。本试验IVCPD 随着猫尾草粒度的增加而升高，其中，12.50 mm 组显著高于1.00、2.36 和3.35 mm组，然而韩海珠等［27］研究发现，在人工瘤胃试验中大颗粒组（5 mm）日粮IVCPD 大于小颗粒组（0.45 mm），本试验结果与此相反，可能是长粒度猫尾草在瘤胃内的流通速率慢，能够充分促进养分消化，因此IVCPD 随着猫尾草粒度的增加而升高。此外，因试验所用尼龙袋孔径为0.045 mm，发酵液流出时过滤网的孔径为1.2 mm，1.00 mm 粒度组在微生物降解过程中许多小颗粒会随着发酵液流出，可能导致发酵参数有误。

3.2 不同粒度猫尾草对体外发酵液参数的影响

pH 是评价瘤胃内环境稳定性的重要指标，它决定着瘤胃微生物对饲粮的发酵和利用情况［28］。本试验中，不同粒度猫尾草经48 h 发酵后的pH 无显著差异，但呈现出先降低后升高的趋势。各粒度猫尾草发酵后的pH 值为5.70～5.94，均处于正常范围值内（5.5～7.5）［29］，且整体偏低，这有利于微生物发酵。pH 值偏低可能与低纤维水平（10% FNDF）饲粮中非纤维性碳水化合物含量较高有关，加之猫尾草木质化程度较低，可降解的纤维含量较高，进入瘤胃后能被微生物快速降解，导致TVFA 迅速增加引起pH 值降低。曾银等［30］研究表明，饲料粒度与瘤胃pH 值的关系存在一个临界粉碎粒度，当粗饲料粒度范围在某临界值以下，会对瘤胃pH 值水平造成影响。周万才等［31］研究报道，在自由采食条件下，直径为3 mm 的颗粒料可以提高肉牛瘤胃发酵速度，降低瘤胃pH 值，当颗粒直径提高至8 mm 时，可以降低瘤胃发酵速度。而Kononoff 等［32］和Yang 等［33］的研究发现，瘤胃pH 值并未受到玉米（Zea mays）青贮颗粒长短的影响。以上试验结论的差异可能是因为饲粮颗粒大小存在临界值造成的。

NH3-N 是瘤胃中粗蛋白质降解的终产物，也是瘤胃微生物合成菌体蛋白的来源，可以反映瘤胃中含氮物质的供应和利用情况［34］。本试验中4.75 mm 组NH3-N 浓度显著低于12.50 mm 组，Hildebrand 等［35］也报道了大颗粒组（4 mm）NH3-N 浓度显著高于小颗粒组（1 mm），本试验结果与此一致。李杰等［36］研究表明，饲喂较大颗粒（2.5～5.0 mm）的豆粕会降低瘤胃外流速度。因而12.50 mm 的猫尾草在瘤胃中停留时间长，致使微生物的分解时间增加，由此提高了NH3-N 浓度。

VFA 是碳水化合物发酵的最终产物，其含量及组成比例是反映瘤胃消化代谢活动的重要指标［37］。本试验中，当猫尾草粒度增加到12.50 mm 时，TVFA 含量显著升高，乙酸摩尔比和乙酸/丙酸值也最大。Rodriguez-Prado 等［38］和Hildebrand 等［35］研究表明，大颗粒组（分别为3 和4 mm）TVFA、乙酸和乙酸/丙酸均高于小颗粒组（1 mm），本试验结果与此相一致。Benchaar 等［39］和Abderzak 等［40］认为，NDF 水平低的日粮可以提高淀粉分解菌的活性从而促进丙酸和丁酸的合成。本试验结果显示，粒度为1.00 mm 时显著提高了丙酸摩尔比，粒度为2.36 mm 时显著提高了异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸摩尔比和IVNDFD。这说明在低NDF 水平下随着猫尾草粒度的减小，提高了淀粉在瘤胃中的消化率和IVNDFD［33，41］，进而增加了其降解产物丙酸和丁酸的产生。王加启等［42］报道，饲粮组成、碳水化合物的来源及加工处理技术和瘤胃环境是影响瘤胃发酵与VFA 产生量和比例的因素。本试验中各组饲粮组成和碳水化合物来源均相同，VFA 含量及其比例是受到饲料加工处理和瘤胃环境的影响。

3.3 体外瘤胃发酵特征与微生物相关性分析

瘤胃细菌附着于饲料颗粒表面，通过侵蚀方式逐渐降解植物细胞壁［43］，且能分泌纤维素酶和蛋白酶等消化酶［44］，由多种细菌和酶相互协同作用才能使结构复杂的纤维降解［45］，最终产生可用于生长和维持的终产品使宿主受益，因此瘤胃微生物对宿主的生存至关重要。本试验结果表明，B.f 与丙酸摩尔比呈正相关，与pH 值呈负相关。当粒度为2.36 mm 时，B.f 数量和IVNDFD 都显著升高，丙酸摩尔比也相对较高，而48 h 时pH 值相对较低。这表明羔羊瘤胃内B.f 降解纤维素的能力在粒度为2.36 mm 时最强，发酵程度较好导致pH 下降［31］。Mba 与pH呈负相关，TB 与乙酸摩尔比呈正相关；当粒度为4.75 mm 时，48 h 的pH 值最高，TVFA 和Mba 数量显著降低，乙酸摩尔比和TB 数量也最低。此结果表明，粒度为4.75 mm 时瘤胃内发酵程度较低，TVFA 含量低，pH 值上升，幼龄动物对乙酸的利用率随着产甲烷菌数量的减少而降低。许多瘤胃细菌代谢产生乙酸，生长也需要乙酸［46］，成艳芬等［47］研究表明，产甲烷菌可以利用其他微生物的代谢产物乙酸生成甲烷，从而降低动物体对乙酸的利用率。本试验中，TB 与NH3-N 浓度呈正相关，TMe 与IVCPD 呈正相关，这说明随着瘤胃内发酵程度的提高，蛋白质降解度增加，NH3-N 浓度也相应升高，为瘤胃微生物提供了丰富的氮源，从而增加了TB 数量，提高了产甲烷菌对氮的利用率。研究表明，饲料粒度影响通过瘤胃的食糜大小和在瘤胃内的停滞时间，从而影响瘤胃微生物的活性［48］。然而，目前不同粒度对低纤维水平饲料发酵特性和瘤胃微生物的影响还存在很大的争议，且体外试验和体内试验结果也存在差异，确定不同粒度猫尾草对瘤胃微生物-宿主的互作关系需要进一步进行动物体内试验的验证。

4 结论

低纤维水平饲料中不同粒度的猫尾草能够调控发酵液中微生物数量，改变其发酵特征从而影响饲料的体外降解率；瘤胃微生物数量与VFA 和养分降解率存在一定的相关性，这种相互作用对幼龄动物的生长发育有一定的作用。