DNA损伤修复与特发性肺纤维化关系的研究进展*

李永霞 综述，江 宇 审校

(重庆医科大学附属大学城医院呼吸科，重庆 401331)

特发性肺纤维化(IPF)是一种病因不明的间质性肺疾病，其特征是肺泡上皮细胞及肺成纤维细胞异常活化增殖、分泌过多的细胞外基质(ECM)，导致进行性呼吸困难、呼吸衰竭甚至死亡。近年来，IPF发病率呈上升趋势，目前病因仍不明确，尚无有效的治疗及预防措施，且此病预后极差，如不进行干预，确诊后的中位生存期仅为2～3年[1]。 因此，明确IPF的发病机制对寻求有效治疗靶点显得十分必要，更是人类对健康的迫切要求。

1 IPF的发病机制

目前，IPF的确切发病机制尚不清楚。最近的研究发现，环境因素、遗传因素、炎性反应、病毒感染、氧化应激等均在IPF的发病机制中起着重要作用[2-8]。一些流行病学研究表明，环境暴露对IPF的发展起着至关重要的作用。IPF的发病与烟草、二氧化硅、金属粉尘之间存在显著相关性[2]。病毒、真菌和细菌等微生物在IPF的发病机制中也发挥了作用。IPF患者与健康人相比，菌群组成较为不平衡[3]。

IPF的发生也与遗传和基因型有关，研究表明高达1/5的IPF患者其家庭成员也患有肺纤维化。IPF中肺成纤维细胞与凋亡有关的某些凋亡相关基因的启动子区域高度甲基化有关，低甲基化与p53诱导凋亡的成纤维细胞释放的应激反应蛋白TP53INP1上调有关[2]。MUC5B也被证明与家族性间质性肺炎和散发性IPF高度相关。还有报道TERT、TERC等位点也与IPF的发生密切相关[2]。作者对IPF表观遗传学的认识不断增加，这可能会发现新的治疗方法，比如表观遗传学基因调节剂的运用，也许可以有效地预防或延缓肺纤维化的进展。炎性反应被认为是IPF发病的重要组成部分，在整个IPF发生过程中，特别是早期炎症阶段，多种炎症因子参与其中，如核转录因子(NF-κB)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-8(IL-8)等[4-5]。当机体受到损伤时，巨噬细胞立即产生细胞因子参与炎性反应，随后募集成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞进行修复，而机体受到持续性损伤时，可能造成肺上皮细胞受损、炎症细胞浸润和细胞因子网络调控失衡，从而导致肺纤维化的发生[5]。

肺组织处于含氧环境，比其他组织更容易受到氧化应激损伤，有研究显示，氧化、抗氧化机制失衡是IPF发病机制之一[6-7]。高浓度的活性氧会导致肺泡上皮细胞膜相结构脂质双层的稳定性降低，使DNA单链断裂或破坏，促进含硫蛋白质的交联，使多肽直接断裂成片段，导致细胞损伤和坏死。坏死细胞释放出细胞内的物质，诱导炎性反应并产生更多活性氧进一步损伤邻近组织，可能引起IPF[8]。而其中涉及的DNA损伤也是可能造成IPF发生、发展的重要因素，但目前相关报道较少。

2 DNA损伤修复与多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)

当细胞受到外源性或内源性因素攻击时会发生DNA损伤，DNA损伤方式包括DNA单链断裂和DNA双链断裂。如果DNA单链断裂不能及时修复则可能发展为DNA双链断裂，且DNA双链断裂较为严重，修复较慢也较困难，可能引发细胞功能障碍甚至细胞死亡[9]。

PARP-1是细胞中最丰富的PARP酶，其产生长而分支的多聚二磷酸腺苷核糖(PAR)，共价连接到参与基因转录、DNA损伤修复和细胞凋亡信号传导的靶蛋白上。PARP-1与其他DNA损伤修复蛋白(PARP-2,PARP-3)不同，其N-末端(NTR)较长(≥500个残基)，且与DNA亲和力较高，因此PRAP-1在DNA损伤修复机制中发挥关键作用，其反应快速而有效，被称为DNA损伤的传感器。哺乳动物的PARP-1是一种由6个不同结构域组成的酶，不同结构域分别发挥着DNA结合、催化和调节功能[9]。PARP-1锌指结构域具有识别DNA损伤功能，这对PARP-1的激活至关重要。PARP-1的2个同源锌指结构域F1和F2识别损伤的DNA，F1是PARP-1激活的核心参与者，F2在PARP-1激活中的确切作用尚不清楚。研究表明，F1和F2与DNA的相互作用相似，但F1和F2对DNA的亲和力并不相同，F1的DNA亲和力明显低于F2，但F1对PARP-1的DNA损伤依赖性激活至关重要，而F2对PARP-1的激活可有可无，F2对DNA的高结合亲和力表明F2对PARP-1定位和DNA断裂的维持有重要作用。锌指结构域F3不直接与DNA结合，但其对PARP-1激活也很重要，其包含介导结构域间接触的关键残基，并且在DNA损伤依赖性激活时对PARP-1组装至关重要[9]。PARP-1激活导致PARP-1结构塌陷，其中锌指结构域F1和F3、WGR结构域和催化(CAT)结构域共同与受损DNA结合。CAT结构域包括2个子结构域：螺旋(HD)结构域和ART结构域。WGR结构域是一个DNA结合结构域，位于CAT结构域附近，与5′-磷酸化位点结合，诱导调节HD结构域的构象变化，参与DNA损伤依赖性激活[10]。

PAR以辅酶I(NAD+)为底物，由PARPs合成，在细胞应激反应中最常见。在DNA损伤时，PARP-1以NAD +作为底物，催化单腺苷核糖或PAR与各种受体蛋白结合，这是响应DNA损伤的最早事件[11]。随后DNA修复蛋白和核酸酶被招募到损伤部位，进行DNA损伤修复。PRAP-1对DNA单链断裂及DNA双链断裂均可进行修复，其参与DNA损伤修复的方式有多种，主要包括同源重组、非同源末端结合、错配修复、碱基切除修复(BER)和核苷酸切除修复[12]。其中最常见的是PARP-1通过BER参与DNA单链断裂修复，当DNA在各种因素作用下(如烷化剂)发生单链断裂，PARP-1能迅速识别这些断裂，识别并结合在DNA单链缺口上，介导支架蛋白XRCC1聚集，在断裂部位与其他核心因子(如DNA连接酶Ⅲ和DNA聚合酶β等)组装，以进行DNA损伤修复[13]。PARP-1如何参与DNA双链断裂的修复目前仍不清楚。现报道关于PARP-1参与DNA双链断裂修复的机制有2种：第一种是PARP-1通过参与同源重组修复直接调节DNA双链断裂修复，第二种是PARP-1通过BER等参与DNA单链断裂修复，间接影响DNA双链断裂修复[12]。

PARP-1对DNA损伤修复有重要意义，DNA损伤较轻微时，PARP-1激活可促进DNA修复，维持了细胞的完整性，使细胞得以存活。抑制PARP-1的活性可使DNA损伤无法及时得到修复，出现损伤加重甚至DNA双链断裂等严重情况，最终造成染色体不稳导致细胞凋亡或坏死[14]。目前，PARP-1抑制剂已被用于临床，可以作为化疗药物、免疫治疗和放射治疗的增强剂[14]。PARP-1抑制剂的靶向治疗目前在临床上也被广泛运用于治疗恶性肿瘤，如乳腺癌和卵巢癌。在小细胞肺癌(SCLC)中，在临床前模型中，PARP-1抑制剂和基于铂的化疗相结合显示出优于单独化疗的疗效[15]。PARP-1抑制剂的出现改变了医生对各种恶性肿瘤患者的临床管理方式，给肿瘤患者带来了新的治疗方案选择，对改善患者预后及延长生存期有一定帮助，但PARP-1抑制剂这些药物的长期毒性还需要进一步深入研究。

3 PARP-1与NF-κB

免疫反应和炎性反应的调节是一个复杂的生理过程，对维持生物体的内环境稳定有重要意义。没有免疫反应和炎性反应，机体就无法在充满病原体的世界中生存。炎性反应由一系列复杂的炎症介质参与，各种炎症因子紧密协调才能维持机体适当和及时的反应，不会出现可能对宿主造成损害的过度反应。如果长期存在不适当或过度免疫反应和炎性反应，机体将因这些生理反应造成损害，甚至死亡。因此，促炎和抗炎机制必须维持平衡，人体才能在引发免疫和炎性反应的环境刺激下生存。人体内有许多机制来调节炎性反应。NF-κB长期以来一直被视为炎性反应过程中的中心介质。NF-κB对免疫和炎性反应中涉及的多种基因表达的调节起着关键作用，包括细胞因子、细胞黏附分子、补体因子和多种免疫受体[16-17]。

目前，研究最多形式的NF-κB是由2个亚基p50(NF-κB1)和p65(RelA)组成的异二聚体。细胞未受到刺激时，NF-κB与细胞质中的κB蛋白抑制剂(IκB)结合处于未激活状态，当细胞受到细胞因子[如IL-1、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、脂多糖等]、紫外线、氧化剂等刺激，丝氨酸/苏氨酸激酶诱导IκB磷酸化，随后发生降解，IκB降解后会释放NF-κB二聚体并暴露p50和p65的核定位序列，导致NF-κB移位进入细胞核，与染色质中特定κB共有序列结合，并激活特定的基因亚群，从而启动靶基因的转录。NF-κB的激活可诱导趋化因子(MCP-1)、细胞因子(TNF-α、IL-6)和基质金属蛋白酶(MMPs)的转录，介导炎性反应和纤维化的发生[17-18]。

许多报道表明，PARP-1在NF-κB介导的炎性反应中有重要作用。PARP-1可调节NF-κB等炎症信号转导途径，调节和增强NF-κB转录活性，进一步促进TNF-α、IL-1β和IL-6等多种炎症因子的表达，NF-κB途径是PARP-1调节炎症的中心途径[19-20]。PARP-1基因敲除动物或PARP-1抑制剂已被证明可减少炎性反应[21]。有报道表明在急性髓系白血病患者治疗中，PARP-1抑制剂奥拉帕尼可以减弱NF-κB途径的活性，并降低蒽环类抗肿瘤药物诱导的DNA损伤反应[22]。近年来，PARP-1也被报道是特异性NF-κB依赖性基因激活所必需的，在体内可作为NF-κB的共激活剂，PARP-1通过不同的结构域与NF-κB的2个亚基(p65和p50)相互作用，并在体内与p50和p65一起形成稳定的免疫可沉淀核复合物，从而在炎性反应中发挥作用[23]。还有一些研究表明，持续的DNA损伤可导致PARP-1过度激活，导致细胞NAD+的耗竭，而NAD+再合成会导致细胞三磷酸腺苷储备耗尽，使能量代谢受损，细胞和线粒体功能障碍，最终导致细胞坏死。其中DNA损伤导致的PARP-1过度激活可以产生炎症反馈环，PARP-1通过调节NF-κB的表达促进NF-κB介导的炎性反应，NF-κB通路的激活提高诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的水平，从而增加体内一氧化氮(NO)的生成，导致严重的氧化应激。氧化应激增加时产生的自由基过氧化产物，导致细胞膜破坏，最终可能导致细胞死亡[24]。

4 NF-κB、TGF-β1与IPF

TGF-β是一种多功能细胞因子，参与多种生物学过程，调节各种细胞的增殖、分化、凋亡、黏附和迁移，如巨噬细胞、活化的T细胞和B细胞、未成熟的造血细胞、中性粒细胞和树突状细胞。TGF-β由TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3异构体组成，尽管3种TGF-β亚型结构相似，但它们介导不同的生物学反应。因其细胞组织特异性表达，它们分别与特定的分子和受体的特异性结合发挥作用。除了生理效应外，TGF-β已被证明在免疫调节疾病的发病机制中起重要作用。TGF-β1是一种抗炎因子，对正常发育、组织修复和维持器官功能至关重要，在组织损伤时TGF-β1会发生上调[25]。TGF-β1的上调发生在许多炎症性肺疾病中，例如慢性阻塞性肺疾病、哮喘和IPF。多种促炎细胞因子可在转录水平上调节TGF-β1的表达(如IL-1β、TNF-α等)，TGF-β1作为NF-κB的下游因子，活化的 NF-κB可增加 TGF-β1的表达。TGF-β1启动子上存在AP-1和NF-κB结合位点，在IL-1β的刺激下，p65 NF-κB和c-jun AP-1被招募到TGF-β1启动子的特定结合位点(κB3位点)，随后组蛋白H4和H3在TGF-β1启动子的不同区域高度乙酰化，最后导致TGF-β1活化参与炎性反应和纤维化的发生、发展[26]。

研究表明，TGF-β1在肺纤维化发生、发展过程中起到十分重要的作用。在多种因素导致的肺纤维化中(包括博来霉素、环磷酰胺和射线)均发现TGF-β1含量增高，并且目前认为TGF-β1是肺纤维化发生、发展的中心环节。其在肺纤维化中的主要作用：趋化并促进成纤维细胞；刺激成纤维细胞合成大量合成胶原蛋白；趋化炎性细胞及单核巨噬细胞，合成释放细胞因子；诱导肺泡上皮细胞过度增殖和上皮间质转化(EMT)，从而导致ECM调控失衡ECM沉积。TGF-β信号传导可分为Smad依赖性途径和非Smad依赖性途径。TGF-β1的促纤维化作用主要是通过Smads途径来完成的[27]。

TGF-β通过与受体复合物结合启动细胞内信号传导，受体复合物包含2种跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶，称为转化生长因子-β受体Ⅰ型(TGFβRⅠ)和转化生长因子-β受体Ⅱ型(TGFβRⅡ)。TGFβRⅡ是一种组成性活性激酶，而TGFβRⅠ激酶需要被TGFβRⅡ激酶激活。在大多数细胞类型中，TGF-β直接与TGF-βRⅡ结合。TGFβRⅡ结合的TGF-β随后被TGFβRⅠ识别，后者被招募到复合物中，并被TGFβRⅡ磷酸化。目前已知的有三类Smads，包括受体调节型Smads(R-Smads)、共同介导型Smads(CoSmads)和抑制型Smads(I-Smads)。Smad1、Smad3、Smad5和Smad8属于R-Smads，它们可以通过磷酸化TGFβRⅠ直接被激活，与Smad4形成异源低聚复合物。Smad6和Smad7属于I-Smads，它们可通过与TGF-βRⅠ相互作用来调节R-Smads的活性，主要阻止R-Smads磷酸化并通过泛素蛋白酶降解途径将其降解[27]。TGF-β1信号转导分两步：即TGF-β1与其受体结合及受体的活化和Smads蛋白的激活。在细胞外，大多数TGF-β1处于潜在的形式，或者以潜伏相关肽(LAP)的形式保持失活状态。活化后TGF-β1从LAP上释放，以同源二聚体形式与TGF-βRⅡ结合，同时与Ⅰ型受体结合导致受体异质二聚体的激活，启动下游信号通路。活化的TGF-βRⅠ使Smad2和Smad3分子磷酸化，Smad2、Smad3与Smad4分子结合，形成Smad复合物转移至核内，与各种转录因子相互作用调控相关基因的转录。最终导致目标基因的激活，参与细胞分化、增殖、迁移、EMT等，而Smad7对TGF-β信号转导途径均起抑制作用，因此有人认为Smad7的上调可能是潜在TGF-β1保护细胞免受炎症侵袭和纤维化的重要机制[27-28]。Smad还可与包括NF-κB在内的其他细胞因子相互作用，以调节炎症和纤维化的发生、发展。

目前认为持续慢性炎症反应是肺纤维化发展的驱动力，因为其启动了纤维化阶段。NF-κB在炎症中起着非常重要的作用，参与炎性反应的中心环节，通过调节其靶炎症细胞因子、黏附分子和促炎酶促进肺组织的纤维化。活化的NF-κB还可以通过提高其下游TGF-β1的水平，进一步促进肺纤维化的发生。因此，NF-κB信号通路通过炎性反应参与了IPF的病理生理过程。

总之，TGF-β/Smad信号和NF-κB途径是介导IPF发生、发展的重要途径。

5 小 结

越来越多的证据显示，DNA损伤及修复可能导致IPF的发生、发展，当发生DNA损伤时，PARP-1立即识别并与缺口处结合，募集多种细胞因子进行修复，同时也会发生炎性反应，NF-κB作为PARP-1的共激活因子也参与其中，并且NF-κB可通过激活下游分子TGF-β1进一步促进纤维化的发生。目前，IPF还没有有效的治疗方法，在理论上，作用于上述细胞因子及其信号通路的药物联合应用可能为IPF提供了新的治疗途径和机会。因此，建立与临床病程相匹配的肺纤维化动物模型是进一步寻找潜在治疗药物的关键环节。