桃儿七种子休眠与萌发机制研究进展

宁蓉春 ，刚华本 ，王 娜 ，徐文华

（1.中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2.海东市乐都区上北山林场，青海 海东 810799；3.中国科学院大学，北京 100049；4.中国科学院藏药研究重点实验室，青海 西宁 810008）

桃 儿 七［Sinopodophyllum hexandrum（Royle）Ying］是小檗科鬼臼亚科桃儿七属多年生草本植物，其花美叶奇，根和根茎具有较高的药用价值［1］。目前资源量稀缺亟待保护已列入严重濒危种群，被《中国物种红色名录》、《中国植物红皮书》和《中国珍稀濒危植物名录》收录，属于国家二级保护植物［1-2］。桃儿七具有悠久的药用历史，最初以“鬼臼”之名记载于《神农本草经》，其根、茎、果实等部位在民间及民族药物中广泛使用，果实作为藏药材称“奥木塞”，藏族人民有食用的习惯［3-4］。据文献记载：其性温，味苦、微辛，有毒；具有祛风除湿、活血止痛、祛痰止咳之效；常用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、月经不调、痛经、脘腹冷痛，咳嗽，胎盘不下等症［3-6］。主要分布于我国陕西太白山区，甘肃榆中、和政，青海东南部，四川西部，云南德钦、香格里拉及西藏昌都、林芝等地［7-12］。桃儿七对温度适应性很强，适生于寒冷湿润的环境，生长于海拔1500 m（湖北罗田）～4300 m（云南中甸大雪山）的高山草丛或林边［13-14］。

分根繁殖和种子繁殖是桃儿七主要的育苗方式，桃儿七种子有较强的休眠特性，自然条件下其休眠时间长达十个月［15-16］，严重阻碍对桃儿七的开发和利用。目前对桃儿七种子休眠机制方面的系统研究较少，尚未找到高效破除休眠的技术方法。但随着现代药理学研究的不断深入，发现其根茎主要提取物鬼臼毒素在治疗尖锐湿疣［17］、抗癌与抗肿瘤［18-20］、抗病毒［21-22］等方面有显著药理学活性，使其市场需求日益增加。因此，本文综合国内外文献资料及研究进展对桃儿七种子休眠机制与萌发特性进行综述，以期明晰桃儿七种子高效萌发技术方法，为通过人工规模化种子种苗种植桃儿七提供可行的技术方法和科学的理论指导。

1 桃儿七种子萌发困难的原因

种子的生命力从旺盛时期经历衰老至死亡，是一个复杂的量变到质变的连续过程，由不可抗拒的自然法则所决定，当种子生理成熟时，便逐渐开始老化，生命力逐渐降低［25］。在理想的贮藏条件下，贮藏时间超过一定限度，种子活力丧失其生命便会终止［23-24］，桃儿七种子在4～6℃下，储藏1年就会完全失去活性［26，53］。徐正尧等［27］首次发现桃儿七具有一种适应于自花授粉的传粉机制，整个传粉受精的过程仅需4～6 h［28］。一般条件下，每个桃儿七果实产生20～150粒种子，其平均结实率高达61.29%～91.60%［29］，桃儿七种子在自然条件下具有休眠期长，萌发不良的生理特性，其中种皮、胚乳限制和生理后熟是引起桃儿七种子休眠的主要原因［30］，导致其野生资源量稀缺。一般情况下桃儿七通过种子进行有性繁殖，在良好的土壤及水肥条件下也可通过根状茎增殖产生的侧芽进行繁殖［27］。

现代研究表明种子休眠的原因主要包括：1、种皮障碍：即种皮厚、硬，阻碍种子对空气、水分的吸收进而抑制萌发使其处于休眠状态［31-34］；2、种胚发育不全：种胚发育不完全会导致种子休眠，有些种胚虽已发育完全，但需完成生理后熟才能萌发［35-37］；3、萌发抑制物的存在：有些种子自身含有萌发抑制性物质，抑制其萌发并处于休眠状态［38-39］；4、不良环境：种子在恶劣的环境下难以萌发，处于休眠状态［40-41］。

曹小路等［42］为确定种皮和胚乳是否是限制桃儿七种子萌发的主要因素，采用组织切片和显微技术，对桃儿七种子及其不同萌发期的解剖结构、以及播种后一定时期内的植株生长形态进行了观察，结果发现桃儿七种子由致密的种皮、多层胚乳和种胚构成，由此可以推测种皮和胚乳的限制以及生理后熟是引起桃儿七种子休眠期长难以萌发的主要原因。李承德等［30］通过开展桃儿七种子分离胚培养实验发现桃儿七分离胚和切除2/3胚乳的种子均在第2天开始萌发，萌发率分别为91.1%和90.0%，15 d后长成幼苗且二者长势几乎一致，但是剥离种皮组一直未萌发。由该结果推测，桃儿七种子多层胚乳的结构不利于种胚代谢导致贮藏在胚乳中的营养物质不能被分解和利用，种子萌发的呼吸作用和代谢的生理生化过程受到阻碍，导致桃儿七种子处于休眠状态难以萌发［43-44］。因此我们可以采取酸碱处理蚀破种皮、分离胚培养或将其成熟的种胚进行组织培养等技术手段来打破桃儿七种子的休眠从而提高萌发率。本人所在课题组经过前期的研究也发现，用不同浓度的H2SO4溶液处理桃儿七种子，能显著提高萌发率。

自然情况下，种子的萌发和幼苗的生长会受到凋落覆盖物的影响［45-46］。在植物整个生长过程萌芽阶段和幼苗时期是较为脆弱的阶段，此时植株无稳定的抗逆性，难以应对复杂多变的生长环境，且对土壤和水热条件要求较高［47-49］，恶劣的生长环境会影响种子萌发及幼苗的生长，造成种子或植株坏死。张高翔等［50］为了探究凋落物对桃儿七种子萌发影响的生物化学原因来进一步阐明凋落物对桃儿七种子萌发与幼苗生长的影响，采用野外调查和室内控制相结合的方法，对桃儿七凋落物浸提液进行GC-MS检测。结果表明，凋落物提取液对桃儿七种子萌发及幼苗生长起到一定的抑制作用，种子萌发及幼苗的生长跟浓度呈正相关。因此在大规模人工种植时，尤其在萌发阶段及幼苗生长时期要及时清理种子和幼株上覆盖的凋零物，减少自毒作用对种子萌发及幼苗生长的影响。

李承德［30］等人用桃儿七种子浸提液浸泡小麦和黄瓜种子后观察并记录种子萌发和幼苗生长状况，结果发现小麦和黄瓜种子经桃儿七种子浸提液浸泡后，发芽率分别降低了10.00%和9.33%。小麦的平均高度和黄瓜平均根长分别降低了1.61 cm和0.53 cm，均低于清水对照组，由此推测桃儿七种子中含有萌发抑制性物质，这与张高翔等［50］的研究结果一致，进一步说明桃儿七种子内含有萌发抑制物，存在自毒作用，证明这也是导致桃儿七种子休眠期长，难以萌发的原因。

综上，桃儿七种子休眠期长、萌发困难的原因总结如下：1、致密种皮导致的物理休眠；2、多层胚乳导致的机械休眠；3、生理后熟；4、萌发抑制物形成的自毒作用。后期对于高效破除桃儿七种子休眠技术方法的探索可围绕这四个方面开展。

2 破除桃儿七种子休眠的方法

2.1 低温层积处理打破桃儿七种子的休眠

层积（Stratification）是有效打破种子休眠的常用方法之一［52-54］。对于含有萌发抑制物质而形成生理休眠的种子，层积法最为有效［55，71］。层积处理可以促进种胚形态发育成熟从而打破生理后熟，使萌发抑制性物质含量下降，激素含量发生变化，提高酶活力，进而促进萌发有关基因的表达［56-57］。久西加等［58］通过低温层积处理来解除桃儿七种子休眠，并观测不同层积时期种子胚形态、胚率、发芽率、营养物质含量、内源激素水平和呼吸途径关键限速酶的活性变化，探究低温层积过程中桃儿七种子胚形态及生理生化变化和休眠解除之间的内在联系，结果表明：在低温层积过程中，桃儿七种子胚形态为鱼雷型或子叶型，说明桃儿七种子不存在形态休眠；种子发芽率在层积后期（60～75 d）显著提高（P＜0.05）；层积后种子内淀粉含量及丙酮酸激酶活性、琥珀酸脱氢酶活性显著降低（P＜0.05），其可溶性蛋白和IAA含量显著升高（P＜0.05），萌发促进物和抑制物比例（GA/ABA、IAA/ABA、GA+IAA/ABA）呈升高趋势，种子发芽率与可溶性蛋白呈显著正相关（P＜0.05），该研究结果发现种子内营养物质的分解转化为种子休眠解除过程各代谢活动提供能量，其中淀粉是最主要的供能物质；层积过程中磷酸戊糖途径被活化、萌发促进物和抑制物比例升高，IAA含量显著上升是桃儿七种子休眠解除的关键［58］。因此桃儿七种子的休眠特性不是单一因素决定而是由萌发促进物和抑制物共同调控的结果。

2.2 植物激素处理打破桃儿七种子休眠

种子休眠与萌发受到许多因素的影响，如种子发育的外在环境及内部基因的选择性调控表达等，其中内源性激素发挥着重要的作用，是调节种子休眠与萌发的关键因子［59-60］。内源激素与种子萌发及休眠的关系一直是种子生理生化研究的热点。目前有很多关于种子休眠萌发和植物激素关联性的研究，其中脱落酸和赤霉素被证明是起关键作用的内源信号分子［61-62］。脱落酸有维持种子休眠状态的作用，赤霉素可打破种子休眠从而促进萌发。乙烯作为种子发育气体环境中的重要组成部分，与其他激素交互作用调控种子休眠与萌发［63］。油菜素内酯可以调节植物的光合作用、呼吸作用、蒸腾作用，促进植物叶片RuBP羧化酶的活性，提高叶绿素含量增加CO2的同化能力，从而提高光合速率，解除光对生长的抑制作用［64］。在种子休眠和萌发过程中，随着分子生物学的快速发展和大量突变体的发现，有关种子休眠与萌发的单个激素或各激素间相互调控作用的机理也日益明确，各激素间的相互作用组成一个调控网络，表现出种子休眠与萌发的现象［34］。

2.2.1 脱落酸（Abscisic acid，ABA）对桃儿七种子休眠与萌发的调控作用

在种子萌发过程中，内源激素起着重要的调节作用。其中脱落酸作为传统的五大植物激素之一，在种子发育时期可以引发并促进休眠，抑制种子过早萌发，帮助种子抵御不良环境，其作用机制主要是通过调节ABA相关的基因或功能蛋白的表达影响种子萌发［65］。早期阶段发育中的种子内ABA积累量较低，发育中期ABA累积量最大，伴随着种子的成熟干燥而下降［66］。农业上常使用脱落酸作为种子的萌发抑制剂，阻止种子穗发芽，有利于种子的贮藏造福于农业生产生活。

叶耀辉等［69］通过离体胚培养、生物鉴定以及GA3（Gibberellin acid ）浸种、低温层积等方法处理桃儿七种子，并采用HPLC法对桃儿七种子破休眠过程中内源激素吲哚乙酸、赤霉素以及脱落酸含量变化进行动态测定来研究桃儿七种子萌发特性及其在不同破除休眠处理过程中内源激素的变化规律，为桃儿七种子的破除休眠和种质资源贮藏奠定基础，结果发现提高GA/ABA值可有效促进种子萌发，GA和ABA在调节种子萌发过程中呈拮抗作用，其中ABA含量与种子萌发率呈负相关。桃儿七种子在不同破除休眠处理组间ABA含量有极显著差异，处理组ABA含量与对照组（CK）均达到极显著差异，随着ABA含量的降低，种子萌发率规律性提高［67］。桃儿七种子内ABA含量的动态变化过程基本遵循萌发率增大ABA含量减少这一规律与久西加等［58］通过等温层积破除桃儿七种子休眠并且测到的内源性激素活性的变化与休眠与萌发的内在联系的结果是一致的。

2.2.2 赤霉素（Gibberellic acid，GA3）对桃儿七种子休眠与萌发的调控作用

赤霉素是一类广泛存在的植物激素，对植物生长有重要影响［62］。众多研究表明赤霉素通过促进种胚发育解除种子的生理性休眠、弱化胚乳、提高α-淀粉酶的活力以及超氧化物歧化酶、过氧化物酶、等活性促进大分子物质降解，加快降解可溶性蛋白从而增强种子活力来促进种子休眠破除提高萌发率［68］。李承德等［30］用低温层积与GA3浸种的综合处理开展桃儿七种子的萌发实验，该研究表明GA3对于打破种子休眠，提高种子活力具有显著促进作用。对桃儿七种子进行不同浓度GA3溶液处理的结果发现：不同浓度的GA3处理相较于CK组能提高发芽率和发芽势，说明在破除桃儿七种子休眠过程中不同浓度赤霉素处理具有显著提高其萌发的效果。在后期的研究中可以探究先用化学试剂处理再结合赤霉素和低温层积来破除桃儿七种子休眠提高其萌发率。

ABA和GA3是种子休眠获得和解除过程中起关键作用的内源信号分子，其中ABA诱导种胚细胞停止分裂、启动并维持种子休眠，而GA3则启动和促进种子萌发，两者在调节种子休眠和萌发过程中形成拮抗作用［72］。在生理水平上：ABA和GA3合成和分解代谢之间的动态平衡是促进种子萌发和休眠平衡的关键，决定种子的萌发能力。在分子水平上：ABA和GA3间的拮抗作用体现在转录因子的相互调节［69］。低温层积处理可以促使种子内部激素变化、抑制物质降解、大分子物质转化成小分子物质、提高一些酶的活力、促进有关基因的表达、增强种皮透性以及降低胚对脱落酸的敏感性等，再加上外源性促进生长的激素处理［70］。因此在低温层积过程或者低温层积处理后再使用植物激素处理种子，均比单一使用植物激素处理对于提高种子发芽率和萌发势更加显著，这也为后期运用植物激素处理促进桃儿七种子的萌发提供了实验思路。

2.2.3 对苯二酚对桃儿七种子休眠与萌发的调控作用

栗孟飞等［51］为进一步深入解析桃儿七种子休眠机制，采用气质联用仪对桃儿七种子的乙醚浸提液进行分离与鉴定，结果表明，分离鉴定出的脂肪类、烷类、酸类等19种化合物中，多数化合物已被前人证明具有生物抑制活性，其中对苯二酚是该实验首次从桃儿七种子浸提液中分离出的有机化合物，并利用对苯二酚浸泡小麦种子进行生物活性鉴定实验，结果发现0.1～1.0 mg/L的对苯二酚可显著促进小麦的生长。在桃儿七种子分离胚培养基中添加1.0 mg/L的对苯二酚，发现桃儿七无菌苗的生长被显著促进，且缩短了生长和发育周期，植株生长状况良好。此结果证明对苯二酚在植物的生长和发育方面具有类似于植物生长激素的促进效果，同时也可以促进种子萌发［73］。对苯二酚在桃儿七种子中含量相对较低使得对苯二酚在桃儿七种子萌发及生长过程中的生物活性强度相对降低［72］，所以并未显示出促进萌发和植株生长、发育的生物活性。目前对于对苯二酚在调控种子萌发及植物生长发育中的应用研究在中外文献中报道颇少，其作用机制有待进一步研究。

3 展望和思考

繁殖是植物生活史上的关键时期，其中种子是植物生活史中重要的组成部分，对保护植物活动和延续植物多样性至关重要，并且种子具有体积小的特点可增加每个储存区域储存繁殖体的密度［74］。种子的萌发决定种子扩散，进而影响植物生长的区域和时间［76］。一般来说，除了顽拗性种子以外，绝大多数植物的种子都具有休眠特性［77］。种子休眠是植物生长发育过程中的一个暂停现象，或称为“生命的隐蔽” 现象，是植物经过长期演化而获得的一种对环境条件及季节性变化的生物学适应性，通过这种适应性物种得以不断生存、发展和进化［77］，是一种原始性状，对于植物完成整个生活史十分必要［74-75］。通过休眠特性改变繁殖体对环境因子的敏感性，从而调节幼苗的出土时间维持种群的存在和更新［78-79］。目前对于濒危藏药桃儿七种子休眠特性的研究迫在眉睫。其根茎主要提取物中鬼臼毒素及其衍生物对于治疗乳腺癌、宫颈癌、和尖锐湿疣，均具有较显著的临床治疗效果［17-18，20］。国内外学者对桃儿七根茎提取物鬼臼毒素的药理作用、新化学成分的挖掘、现代临床剂型的开发，以及衍生物的不断修饰和创新，为癌症和感染人乳头瘤病毒的患者带来了新的希望。

在前人的研究基础上可采用其他破除种子休眠处理方法拟找到一条高效破除桃儿七种子休眠的技术方法。通过使用恒温冷层积加其他植物激素处理或根据相关文献设置其他植物激素或化学试剂处理的单因素或多因素实验来提高其萌发率。并基于代谢组学和转录组学综合解析桃儿七种子的萌发特性和休眠机制，挖掘控制桃儿七种子萌发和休眠的调控基因和信号转导途径，以及各处理破除休眠过程中种子内生理生化指标的变化来综合确定并解析破除休眠提高萌发的技术方法。现代研究表明乙烯可以促进种子萌发［80-81］，其作用机制主要是通过降低组织对内源ABA的敏感性来负向调节 ABA的信号在种子休眠中的作用来促进种子萌发，或弱化珠孔胚乳组织来促进种子的萌发［82-83］。因此可以使用乙烯诱导桃儿七种子萌发，以期能缩短桃儿七种子的休眠期，更加显著的提高其萌发率，为桃儿七的大规模仿生态种植提供大量种苗。

油菜素甾醇（Brassinosteroids，BR）是一类在植物生长发育过程中发挥多种作用的类固醇激素［84-86］，BRs家族中最活跃的成分是油菜素内酯，它能够激活BR信号，与其他植物激素一起调控植物的生长发育［87］。用油菜素内酯诱导桃儿七种子的萌发，探索油菜素内酯在桃儿七种子休眠破除诱导萌发过程中的作用机制，并将植物激素、化学试剂以及物理方法综合处理诱导萌发的实验过程中观察桃儿七种子胚形态、内源激素、营养物质及呼吸和代谢过程中关键酶活性的动态变化来明晰桃儿七种子萌发特性和休眠机制。

本人所在研究组前期已开展了大量桃儿七的相关研究工作，奠定了扎实的研究基础，本人在此基础上分别从低温层积、植物激素和化学试剂处理的角度出发开展桃儿七种子破除休眠与促进萌发的研究工作，目前取得的一些实验结果与本综述引用的文献结果是一致的。另外从内源激素含量变化、营养物质代谢及种子萌发过程中呼吸代谢关键酶活性和休眠调控关键基因等角度出发，拟联合代谢组学和转录组学技术方法探究并解析桃儿七种子休眠及萌发机制，总结出一条高效破除桃儿七种子休眠、显著提高萌发率的技术方法，希望此技术方法为桃儿七规模化人工仿生态种植提供技术指导，更为野生桃儿七资源的保护、鬼臼毒素化合物的生产、综合开发利用奠定可行的技术方案和扎实的理论依据。