结直肠癌组织中Lgr5、GATA6表达变化及临床意义

于思雨，荣光宏

1 青海大学研究生院，西宁 810000；2 广东医科大学附属东莞第一医院消化内科

据2020年世界癌症统计指出，在36种常见癌症中，结直肠癌（CRC）新发病例超过190 万，死亡人数93.5 万，约占癌症病例和死亡人数的1/10，其发病率和死亡率排名分别为第3、4 位［1］。CRC 早期临床症状隐匿，很多患者在首次接诊时已进展为中晚期，早期诊断率极低。此外，CRC 预后较差，大大降低了患者的5 年生存率。CRC 的患病年龄趋于年轻化，其死亡原因与肿瘤侵袭和远处转移有密切关系。因此，寻找高特异性和高敏感性的肿瘤标志物，可以为CRC 的早期诊断和治疗提供新的思路。有研究发现，肿瘤干细胞（CSC）是恶性肿瘤中具有自我更新和多向分化潜能的细胞群，与肿瘤复发、转移及耐药等密切相关［2］。富含亮氨酸重复单位的G 蛋白耦联受体5（Lgr5）是肿瘤干细胞表面标志物，其参与肿瘤的形成、转移、复发和治疗抵抗［3-4］。转录调节因子GATA 结合蛋白6（GATA6）能增强尿激酶型纤溶酶原激活物的活化性，提高癌细胞侵袭和转移能力，也可以通过抑制15-脂氧合酶-1 的表达调节CRC 细胞增殖［5-6］。本研究探讨Lgr5 和GATA6 在结直肠癌组织中的表达变化及临床意义，为CRC 的早诊断、早治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年1月—2021年12月就诊于青海省人民医院的CRC患者41例，均行手术切除 治疗，男24 例、女17 例，年 龄30～89（60.61 ± 13.23）岁；分化程度为低分化8 例、中高分化33 例；TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期22 例，Ⅲ、Ⅳ期19 例；浸润深度未及浆膜10 例，侵及浆膜及浆膜外31 例；有淋巴结转移17 例，无淋巴结转移24 例。纳入标准：术后病理检查确诊为CRC；术前未行放化疗；未合并其他恶性肿瘤及重大基础疾病。排除标准：合并其他良性或恶性肿瘤；合并心、脑、肝、肺、肾等脏器功能衰竭；合并癌症相关炎症性肠病和家族性腺瘤性息肉病；妊娠期、哺乳期；正在参与其他医学研究；临床病理资料不完整。本研究经青海省人民医院医学伦理委员会批准，患者或家属签署知情同意书。

1.2 标本采集 术中取41例CRC患者的癌组织及配对的癌旁正常组织（距离癌组织边缘＞5 cm），用4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，使用石蜡切片机进行切片，厚度为4 μm。

1.3 Lgr5、GATA6 蛋白表达检测 采用免疫组化法。取上述两种组织切片，依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中各浸泡10 min，随后依次放入100%、100%、95%、70%、50%、30%乙醇及蒸馏水中各浸泡5 min。取出置于PBS 液中，于摇床上洗涤3 次，每次3 min。每张切片滴加3%过氧化氢去离子水阻断内源性过氧化物酶活性，室温下避光孵育10 min。取出后置于PBS 液中，于摇床上洗涤3 次，每次3 min。将柠檬酸盐抗原修复液于微波炉高火加热5 min，沸腾后放入组织切片，加盖，然后低火加热20 min。取出后置于PBS 液中，于摇床上洗涤3 次，每次3 min。用10%正常山羊血清封闭非特异性抗原，室温下封闭40 min。甩去多余液体，根据组织大小，滴加稀释的一抗兔抗人Lgr5多克隆抗体、兔抗人GATA6多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）稀释比例分别为1∶300、1∶100），置于湿盒中4 ℃冰箱孵育过夜。次日取出湿盒，将组织切片置于PBS液中，于摇床上摇动洗涤3 次，每次5 min。吸水纸擦干切片，滴加适量二抗（Polyperoxidase-anti-Rabbit-IgG 即用型），需完全覆盖组织，室温下孵育2 h。然后置于PBS 液中，于摇床上摇动洗涤3 次，每次5 min。擦干组织周围液体，每张切片滴加50 μL现配的DAB工作液，显微镜（×400）下观察显色情况，然后自来水洗涤终止显色。苏木素复染细胞核2 min，用自来水清洗，返蓝。将切片置于无水乙醇3 min、二甲苯3 min 脱水透明。晾干后用中性树胶封片，显微镜（×400）下拍照。结果判定：Lgr5阳性染色主要定位于细胞质，GATA6 阳性染色主要定位于细胞膜和细胞质，均呈棕黄色颗粒。显微镜下每张切片随机计数10 个高倍视野（×400），观察细胞染色情况，对染色强度、阳性细胞百分比进行评分。染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比评分：阳性细胞百分比≤5%计0 分；5%＜阳性细胞百分比≤25%计1 分；25%＜阳性细胞百分比≤50%计2 分；50%＜阳性细胞百分比≤75%计3分；阳性细胞数＞75%计4分。以上两项评分相乘≥3为高表达，＜3为低表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计数资料比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman 秩相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC 组织及癌旁正常组织中Lgr5、GATA6 蛋白表达比较 CRC 组织及癌旁正常组织中Lgr5 蛋白高表达率分别为60.98%（25/41）、12.20%（5/41），比较差异有统计学意义（P＜0.05）；CRC 组织及癌旁正常组织中GATA6 蛋白高表达率分别为63.41%（26/41）、21.95%（9/41），比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 Lgr5、GATA6 蛋白高表达与CRC 患者临床病理特征的关系 Lgr5 蛋白高表达率与CRC 的TNM分期、淋巴结转移有关（P均＜0.05），与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度和浸润深度无关（P均＞0.05）。GATA6 蛋白高表达率与CRC 的浸润深度、淋巴结转移有关（P均＜0.05），与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度和肿瘤分期无关（P均＞0.05）。见表1。

2.3 CRC 组织中Lgr5、GATA6 蛋白表达的相关性 Spernman 秩相关分析结果显示，CRC 组织中Lgr5、GATA6蛋白表达呈正相关（r=0.327，P＜0.05）。

3 讨论

临床上大多数CRC 患者在确诊时已是中晚期，错过最佳手术时机，大大降低了CRC 患者的生存率。目前，肿瘤相关标志物检测已广泛应用于临床，作为一种常规的肿瘤筛查方法以辅助肿瘤的诊断和评估预后。了解CRC 的发生机制并进行早期干预，对提高CRC的疗效和延长患者生存期有重要意义。

研究表明，肿瘤干细胞虽然数目极少，但在肿瘤干细胞内与早期胚胎发育相关的多种信号通路被异常激活，从而呈现出强致瘤能力及细胞分化能力，信号通路的激活可通过相关生物标志物进行监测［7-8］。因此，通过检测肿瘤干细胞标志物在肿瘤组织中的表达及与临床病理特征的关系，可以为肿瘤的早期诊断及治疗提供重要依据。Lgr5 是一种7 次跨膜的G 蛋白，具有17 个富含亮氨酸重复序列，在食管腺癌、肝细胞癌、卵巢癌、基底细胞癌及CRC 中呈现高表达，并且在这些恶性肿瘤的病情进展中发挥重要作用。研究表明，Lgr5是Wnt信号传导的靶基因，可参与细胞外基质蛋白、胶原蛋白及纤黏蛋白的表达，也可参与调控CRC 细胞中Wnt/β-catenin 信号通路的激活，从而促进肿瘤细胞的增殖及侵袭等生物学行为［9］。GATA6 属于转录调节因子GATA 家族，具有高度保守的锌指结构，参与细胞的多种生物学行为，其异常表达与肺癌、卵巢癌、口腔癌、消化道肿瘤等的发生发展密切相关［10］。研究发现，GATA6 在CRC 患者中表达增加，参与肠上皮细胞分化，通过激活Wnt/β-catenin信号通路发挥促癌作用［11-12］。此外，Lgr5、GATA6 与肿瘤的直径、浸润深度、分化程度、TNM 分期和淋巴结转移等临床病理学特征有关［13-16］。肿瘤TNM 分期是由肿瘤原发灶情况、淋巴结转移、远处转移共同决定。TNM 分期越高，肿瘤恶性程度就越高。研究发现，在CRC 组织中GATA6表达阳性率高于癌旁组织，且TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期及低分化、浸润深度深、有淋巴结转移的患者，GATA6阳性率高，提示GATA6表达与CRC发生和进展密切相关［15-16］。本研究结果显示，Lgr5、GATA6 在CRC 组织、癌旁正常组织中均有表达，但CRC 组织中Lgr5、GATA6 的高表达率明显高于癌旁正常组织，提示两者与CRC 的发生发展有关。同时，在TNM 分期为Ⅲ、Ⅳ期和有淋巴结转移的CRC 患者中，Lgr5 的高表达率高；在肿瘤的浸润深度达浆膜及浆膜外、有淋巴结转移的CRC 患者中，GATA6的高表达率高。提示Lgr5、GATA6 的表达与CRC 的恶性生物学行为有关，可作为评价肿瘤浸润、转移倾向的指标之一。

此外，有研究指出GATA6 可以通过结合至Lgr5的启动子区调控Lgr5 的表达，进而影响结直肠肿瘤细胞系的成瘤能力，抑制CRC 细胞系GATA6 的表达，可下调Lgr5 的表达并进而降低其致瘤能力［17-19］。GATA6 长非编码RNA（lncGATA6）在Lgr5 阳性表达的人肠干细胞（ISC）中高表达，如果敲除或条件性敲除ISC 中的lncGATA6，则会损害ISC 的干性和上皮再生，从而说明lncGATA6 维持肠道干细胞的干性并促进肿瘤的发生；其发生机制可能为lncGATA6将NURF 复合物募集到Ehf 启动子上，以诱导其转录，促进LGR4/5 的表达，以促进Wnt 信号通路的激活，进而促进肿瘤发生发展，这表明长非编码RNA可通过调控Lgr5 或影响Lgr5 阳性CRC 干细胞的生物学特性，从而促进CRC 的发展［20-21］。本研究结果显示，Lgr5和GATA6在CRC组织中的表达表现为正相关，两者共同促进CRC 的发展。这提示Lgr5 和GATA6都可作为CRC 治疗的靶点，联合靶向治疗可能会提高CRC的疗效。

综上所述，Lgr5 和GATA6 在CRC 组 织中高表达，与CRC 的恶性生物学行为有关，且二者共同参与CRC 的发生发展，因此检测Lgr5 和GATA6 有助于CRC 患者的诊断及预后评估。但本研究样本量相对较少，且未对Lgr5、GATA6 的作用机制进行研究。因此，未来仍需开展大样本、多中心的临床研究进一步论证本研究结果，寻找诊断效能更高的标志物或联合诊断标志物。