中药调控Notch信号通路治疗骨质疏松症的研究

杨浩东 谢兴文 李宁 李鼎鹏 丁聚贤 姚乾宁刘凯

1. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州730000 2. 甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州730000 3. 甘肃省第二人民医院/西北民族大学附属医院，甘肃 兰州 730030

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种全身性骨代谢疾病，主要由于骨代谢过程中各种致病因素造成成骨细胞(osteoblast,OB)与破骨细胞(osteoclast,OC)介导的骨形成和骨吸收失衡，导致骨吸收大于骨形成。主要表现为单位体积内的骨量减少、骨密度(bone mineral density,BMD)下降以及骨微结构的改变，以致骨的脆性增加，增加患者的骨折风险[1-2]。据研究调查[3]，在我国50岁以上的人群中，男性的患病率约为6.46%，而女性由于绝经后体内雌激素分泌减少，患病率达到了29.13%，尤其在60岁以上人群中，OP患病率明显增高。由OP并发的骨质疏松性骨折已成为造成中老年人群残疾和死亡的主要原因之一[4]，给患者及家庭带来了沉重的经济负担和严重的社会负担[5]。

目前，在临床上治疗OP主要以西医治疗为主，患者通过服用甲状旁腺素、维生素D等促进骨形成的药物以及降钙素、双膦酸盐等抑制骨吸收的药物来改善骨质情况，但是这些药物都有明显的不良反应和副作用[6]，并且临床治疗效果也难以令人满意。近年来，中医药以其多生物活性成分、多靶点、多通路协同、高效价廉和副作用少的治疗优势在OP的防治中发挥了重要的作用，并且取得了良好的临床疗效。神经源性位点缺口同源蛋白(Notch)信号通路作为细胞内一条重要的信号传导通路，能够参与多种疾病的发生和发展。相关研究证实[7]，Notch信号通路作为重要的骨重建通路在调控与维持骨代谢稳定方面发挥着至关重要的作用，可以通过影响OB和OC的分化和平衡，从而促进骨的形成，抑制骨的吸收，是当今研究和治疗OP的新靶点。因此，可以通过调控Notch信号通路相关蛋白的表达，影响相关骨细胞的代谢，从而纠正机体的骨失衡状态，恢复成骨量与破骨量之间的动态平衡。本文将对中药单体及复方调控Notch信号通路防治OP的相关研究进行综述，阐明运用中药单体及复方干预影响Notch信号通路相关靶蛋白的表达治疗OP的作用机制，以期为运用中医药更好的防治OP提供有益参考。

1 Notch信号通路

1.1 Notch信号通路的组成

摩尔根在做果蝇突变实验时发现了Notch信号通路，因其代表的功能缺失使得果蝇翅膀形成缺刻而命名[8]。Notch信号通路在高、低等动物体内均有表达，具有高度保守的特性，主要由受体、配体、DNA结合蛋白、DNA结合蛋白胞内效应分子、效应物以及调节分子组成。在哺乳动物体内，Notch通路主要由4种受体蛋白(Notch-1、2、3、4)和5种配体蛋白(Delta-1、3、4，Jagged-1、2)以及Notch调节因子及下游发状分裂相关增强子(hairy and enhancer of split,Hes)、Hey蛋白组成[9]，在细胞的增殖和分化以及凋亡等过程中有着十分重要的调控作用[10]，在许多生物体内的组织和器官中都发挥着重要的作用。

1.2 Notch信号通路的激活过程

Notch通路以细胞间接触的方式进行信号传递，因此又被称之为复合信号结合蛋白-J(recombination signal binding protein-J,RBP-J)依赖通路，其通过细胞表面的配体蛋白与相邻细胞表面的受体相结合的方式进行信号传递过程。Notch通路的活化需要经过三个阶段[11]：①受体蛋白是由多肽段构成的异二聚体，在内质网合成之后，转移至高尔基体，在弗林蛋白转化酶的作用下，行第1次酶切，被切割为N端胞外配体结合区和C端跨膜亚单位；②在配体与受体结合后，在去整合素金属蛋白酶作用下，行第2次酶切，使受体释放细胞外亚单位；③切割产生的Notch片段被γ-分泌酶第3次酶切，释放Notch细胞内区(notch intracellular domain,NICD)入核，在细胞核内与转录因子RBP-J、智者基因样特异性结合形成核转录激活蛋白家族复合体，对下游Hes、Hey蛋白进行调控，转录下游基因发挥生物学功能[12]。

2 Notch信号通路与OP

2.1 Notch信号通路对OB的影响

OB是骨形成的主要功能细胞，能够影响骨的形成和重建过程，来源于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)。OB由BMSCs分化而来，此过程经历了由不同转录因子及信号蛋白调控的多个阶段。研究发现[13]，Notch信号通路能够影响OB的增殖、分化和骨化等过程，能够激活BMSCs前体向OB分化。Notch通路在调节过程中具有双向调节的作用，在早期成骨分化中发挥促进成骨的作用，而后期则抑制OB的增殖和分化。激活BMSCs中的Notch信号通路，不仅可以促进BMSCs的增殖，而且能够维持其干细胞特性，抑制BMSCs的分化，而在BMSCs中抑制Notch信号通路的激活，则可以促进干细胞的分化，使其进入成骨或成软骨的状态[14]。研究发现[15]，Notch信号通路的配体蛋白Jagged-1是BMD的决定因子，Jagged-1蛋白的大量表达能够促进骨折的早期愈合，并且抑制BMSCs高密度长期培养所导致的细胞老化，增强其成骨分化。Notch信号通路能够正向调节骨形成蛋白信号抑制剂头蛋白(Noggin)的释放，从而促进骨小梁形成，增加成骨前体细胞的数量[16]。

2.2 Notch信号通路对OC的影响

OC是骨吸收的主要功能细胞，在骨的发育、成长、修复和重建过程中发挥着重要作用，来源于骨髓造血干细胞。有报道[17]指出Notch信号通路与OC的增殖和凋亡过程密切联系，通过下调Notch信号通路的活性可以达到抑制OC凋亡，增加OC增殖能力的作用，Notch通路中的Nocth-1蛋白高表达可以促进δ样配体3、Jagged-1的表达，使OC形成数量明显减少[18]，而Nocth-2的表达量与OC的增殖能力呈正相关。相关研究[19]发现，微小RNA对OC的活性有着重要的影响，miR-187可以通过增强Nocth-1通路的活性，抑制Nocth-2通路达到抑制OC的增殖与分化，并且诱导OC凋亡，减少OC的存活。

3 中药调控Notch信号通路与OP

3.1 中药单体

随着对中药单体研究的深入，大量实验结果表明，中药单体在防治OP方面有着显著的治疗效果。骨碎补作为骨科常用药，现代药理学研究证明[20]，其主要有效成分总黄酮(davallia mariesil flavones,DMF)能够维持OP患者的骨微结构的完整程度，并提升BMD。研究证实[21]，DMF能够显著降低骨髓基质细胞中Notch-1 mRNA、Hes-1 mRNA以及Notch-1、Hes-1等蛋白的表达水平，其促进骨形成，抑制骨吸收，增加BMD的作用机制与Notch信号通路相关。前期研究证实[10]，齐墩果酸(oleanolic acid,OA)能抑制Notch信号通路的激活，且呈现剂量依赖性，能够促进BMSCs早期的OB分化，从而促进骨形成。程韶等[22]通过微型渗透泵对去势大鼠骨折部位进行局部缓释OA干预，实验发现，OA能够促进骨折的愈合，且干预14 d的作用显著大于28 d，证实了OA能够促进早期骨形成，通过降低骨痂组织中Hes1 mRNA的表达，抑制Notch通路靶基因Hes1的表达从而促进BMSCs的成骨分化。白藜芦醇(resveratrol,RES)是中药虎杖的活性单体，研究发现[23]RES能够通过调控Notch通路，上调Notch-1的表达，上调cyclin-D1的m RNA转录水平，而下调负调控细胞的分裂及增殖的p53的m RNA转录水平，促进大鼠骨组织中的OB增殖。淫羊藿作为传统中药，最早见于《神农百草经》，具有补肾壮阳，祛风除湿的功效[24]。淫羊藿苷作为淫羊藿的主要有效成分之一，研究[25]发现其具有维持骨代谢平衡、诱导骨形成、增加BMD的作用。淫羊藿苷能够促进Notch通路中Notch-1、Jagged-1 、C-启动子结合因子-1等蛋白的表达，上调Hesl mRNA和Runt相关转录因子2 mRNA表达，促进BMSCs向OB分化，从而发挥防治OP的作用[26]。

另有研究指出[27-29]，刺五加苷、补骨脂素和连翘酯苷A等中药有效成分均能通过介导Notch信号通路干预BMSCs的成骨分化，并且影响相关骨细胞的凋亡防治OP。

3.2 中药复方

中医认为，OP发生的根本病因是由于患者肝肾亏虚所引起，如《黄帝内经·素问》中所云“肾气热，……骨枯而髓减，发为骨痿。”在治疗方面，《素问》曰 “肾者，……封藏之本，……其充在骨，……通于冬气。”明确了肾具有壮骨生髓的作用。因此，从古到今各代医家治疗OP的遣方用药都以补肝肾为要，并且在临床的应用中取得了良好的治疗效果。

刘蔚楠等[30]探讨了益肾健骨膏对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢的影响，研究发现模型组大鼠腰椎中的Notch 1、2及其配体Jagged 1、2的mRNA及蛋白表达均显著降低，而在经过益肾健骨膏的治疗后，高剂量膏方组中大鼠的BMD、骨强度及骨形成指标都显著提升，而骨吸收的指标水平显著降低，并且除模型组之外，其余各组中上述基因的mRNA及蛋白表达均显著提高，证明益肾健骨膏可能通过影响Notch通路蛋白的表达促进骨形成，抑制骨吸收，从而减少去势大鼠骨量的丢失。吴结枝等[31]的研究发现，壮骨止痛胶囊能够通过调控BMSCs的Notch信号通路，提高Hes、Notch-1、Jagged-1等蛋白的表达水平，调节BMSCs向OB分化，改善绝经后骨质疏松模型大鼠骨基质的分子结构，提高BMD。许日明等[32]研究了温肾固疏方对绝经后骨质疏松症肾阳虚型患者的影响，发现温肾固疏方组患者在治疗后BMSCs中的Notch-1、Jagged-1、Hes-1的mRNA等蛋白的表达水平均高于其他组，提示温肾固疏方可能通过调节Notch通路提高类固醇受体活化辅激活因子3、过氧化物酶体增殖活化受体-1a、B淋巴细胞瘤-2水平，恢复BMSCs功能，促进OB生长，提高患者BMD。实验证明[33]，固本增骨方能够促进BMSCs进行增殖，并促进其进行成骨分化、而抑制其成脂分化，通过上调Notch-1 mRNA的表达水平以及下调C启动子结合因子1 mRNA水平，从而促使BMSCs成骨分化过程中Ⅰ型胶原蛋白、Runt相关转录因子2、骨钙蛋白等成骨基因蛋白的表达，促进OB的增殖。

另有研究证明[34-39]，补肾方药如左归丸、右归丸、补肾复方和益骨胶囊等均可以通过调控Notch通路活性，影响与成骨和破骨相关细胞的增殖和凋亡，有效发挥骨质疏松症的防治作用。

4 小结

综上所述，现有的研究结果证明中药单体及中药复方治疗OP的效果显著，且具有多方向调节、多靶点干预的治疗特点，可以通过调控Notch信号通路相关蛋白的活性，调节靶基因蛋白的表达，影响BMSCs、OB、OC等细胞的增殖分化和凋亡，维持骨形成和骨吸收的动态平衡，达到防治OP的效果。

但目前基于此通路防治OP的中医药疗法基本以中药单体及中药复方为主，未涉及针灸、穴位贴敷、脏腑推拿等具有中医特色疗法在此方面的研究，且大部分现有的研究也仅停留在动物实验研究的基础阶段，这也是今后应努力研究的方向和目标。下一步应致力于探究临床研究的治疗效果，同时以Notch信号通路为支点，挖掘出更多的中药有效成分和中药复方，扩大中医药特色疗法防治OP的应用范围，探究与其他通路的协同治疗作用。